天宝蕉HOS1基因启动子克隆及生物信息学分析

刘炜婳，林争春，冯 新，赖钟雄

(福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002)



天宝蕉HOS1基因启动子克隆及生物信息学分析

刘炜婳，林争春，冯 新，赖钟雄*

(福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

以天宝蕉叶片为材料，分离天宝蕉HOS1基因的启动子，并进行生物信息学分析。结果表明：天宝蕉HOS1启动子与马来西亚小果野蕉HOS1启动子序列相似性达到92.43%，并含有35种类型顺式作用元件，其中含有多种类型的激素应答作用元件和非生物胁迫有关的顺式作用元件，可能与天宝蕉的冷胁迫应答有密切关系；天宝蕉HOS1启动子预测含有2个CpG岛， 暗示天宝蕉的冷胁迫应答与甲基化也有密切的关系。

天宝蕉Musaacuminata, AAA group；HOS1；启动子；克隆；生物信息学分析

香蕉Musaspp.是芭蕉科Musaceae芭蕉属Musa大型草本植物，其主要分布于东、西、南半球南北纬度30°以内的热带、亚热带地区。世界上栽培香蕉的国家有130多个，我国是香蕉主产区之一。不管是作为大宗水果，还是作为许多国家的主要粮食作物，香蕉的产量对于许多国家的粮食安全或重要水果都具有重要的作用[1]。香蕉具有喜高温多湿，忌寒冷的生长习性[2]，香蕉生长的临界温度为13℃[3]，而我国香蕉栽培的亚热带地区在冬春季常常因遭受低温的侵袭，使得香蕉的生长以及产量受到严重影响[4-5]。就如2016年1月23、24日，全国大范围遭受西伯利亚寒流的侵袭，一些亚热带和热带地区的温度为几十年最低，福建、广东、广西等地区甚至出现了降雪，福建省遭遇了30年来的极端低温，一些地区最低温跌破0℃，甚至达到-4℃。这种极寒的天气使得栽培香蕉的生长经历了严峻的考验。福建漳州天宝镇是福建省香蕉的主栽地区，香蕉种植面积达1 300多 hm2，天宝蕉在这次寒流中受灾范围达90%，一些香蕉的叶片完全呈水渍状。因此，研究与培育抗寒的香蕉栽培种是目前较为迫切的生产上问题。

植物在长期进化过程中，逐步形成了一套复杂而高效的应答机制，能以不同的途径或者综合几条途径来提高自身的抗寒性，抵御和适应低温胁迫[6]。在众多抗寒途径中，DREB亚家族转录因子中的A-1亚组[也称DREB1/CBF(C-repeat binding factor)亚组]转录因子在植物低温应答过程中起着关键调控作用[7-9]。而在拟南芥CBF抗寒途径中，ICE1能特异的与CBF3启动子区域的 E-Box 结合，从而激活CBF3 及其下游靶基因的表达，显著提高植株的抗寒性[10]。ICE1蛋白的转录活性受翻译后修饰的严谨调控，主要包括SIZ1(SAP and Miz 1)介导的 SUMO(small ubiquitin- related modifier)化修饰和HOS1(high expression of osmotically responsive gene 1)介导的泛素化修饰，HOS1-SIZ1 系统精细严谨地调控着 ICE1-CBFs 及其靶基因的表达，以适应外界温度的变化[9,11-12]。因此，在植物CBF抗寒途径中，HOS1作为负调控因子起着重要的作用[13]。

有研究表明，在植物抗寒基因工程中采用诱导型启动子比采用组成型启动子效果更好[14-15]。因此，本研究克隆了天宝蕉Musaacuminata，AAA group的HOS1启动子，并对启动子序列进行生物信息学分析，以期为研究栽培香蕉的冷胁迫应答机制和培育高抗寒能力新品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以天宝蕉Musaacuminata, AAA group的叶片(福建农林大学园艺植物生物工程研究所香蕉种质资源圃)为材料，提取DNA，用于天宝蕉HOS1启动子克隆。

1.2 方法

1.2.1 天宝蕉叶片基因组DNA的提取及其质量检测 天宝蕉叶片基因组DNA的提取参照冯新[16]的方法。

1.2.2 天宝蕉HOS1启动子克隆 参考香蕉Musaaccuminata, AA group基因组HOS1启动子序列信息，利用DNAMEN6软件工具进行天宝蕉HOS1启动子克隆引物的设计，在起始密码子ATG上游约1 900 bp的地方设计上游引物，在起始密码子ATG下游约350 bp的地方设计下游引物。上游引物为HOS1proF：TGA TGA CTT CTC TGT GCA ACT，下游引物为HOS1proR：ACT CAA TTC TCT CTC ATT CCA C。退火温度为57℃，目的片段大小为2 248 bp，延伸时间为2 min。以天宝蕉叶片DNA为模板，经PCR扩增后，将PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小与预测的片段大小相符，利用Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0试剂盒(TaKaRa公司)将目的片段切胶回收，然后连接至pMD 18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性单克隆子，进行菌液PCR鉴定后送测序。引物合成及产物测序委托北京六合华大基因科技股份有限公司进行。

1.2.3 天宝蕉HOS1启动子生物信息学分析 天宝蕉HOS1启动子生物信息学分析的方法有：利用DNAMEN6软件工具进行天宝蕉HOS1启动子序列分析及和香蕉基因组HOS1启动子序列多序列比对；利用BDGP在线预测工具对启动子中转录起始位点及可能的核心启动子区域进行预测(http://www.fruitfly.org/ seq_tools/promoter.html)；利用PlantCARE对启动子中可能存在的顺式作用元件进行预测(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)；利用CpG Islands对启动子区域潜在的CpG岛进行预测(http://www. bioinformatics.org/s ms2/cpg_islands.html)。

2 结果与分析

2.1 天宝蕉HOS1 5端调控序列的获得及与香蕉基因组序列的比较分析

以之前准备好的天宝蕉叶片DNA为模板，结合设计的引物进行PCR扩增后，在2 000 bp左右的地方出现了一条特异条带(图1)与预测的片段大小相符，切胶回收目的条带，加以纯化，进行后续克隆。菌液PCR后，挑选单一较亮的目的条带的菌液送去测序。测序结果得到2 266 bp的DNA序列，经分析，去掉起始密码子ATG及下游的364 bp DNA序列，去掉同一染色体上HOS1上游基因3’UTR的277 bp DNA序列，共得到1 624 bp的HOS1 5端调控序列。将天宝蕉和香蕉Musaaccuminata, AA group基因组HOS1启动子序列进行多序列比对分析(图2)，二者相似性为92.43%。从序列比对可以看出，总体上二者序列具有较高的同源性，又具有一定的差异，这些序列的差异主要集中在启动子区域的下游，这些差异符合5’调控序列的特异性。在一些香蕉不同品种中有出现类似的现象[16]，因此推测这种现象也可能是物种间差异决定的。

2.2 天宝蕉HOS1启动子转录起始位点的预测

利用BDGP工具进行天宝蕉HOS1启动子转录起始位点在线预测。预测结果表明，天宝蕉HOS1启动子中可能存在一处核心启动子区域，分布于-449～499 bp区域，预测分值为：0.82，可能的转录起始位点分别为：A，可能的转录起始区域为：AGC GGT GGG TGA AAA AAT CTC TCC ATC CTT CAG CTC TTC TAA TCA TAA AA。

2.3 天宝蕉HOS1启动子顺式作用元件的预测

利用PlantCARE工具进行天宝蕉HOS1启动子顺式作用元件在线预测，结果如图3。从图中可以看出天宝蕉HOS1启动子共有35种类型顺式作用元件。除了含有大量核心启动子元件TATA-box(32个)和CAAT-box(35个)外，还含有多种类型的顺式作用元件。其中光响应作用元件多达10种，分别为AT1-motif、Box 4、Box I、CATT-motif、G-Box、G-box、GA-motif、GT1-motif、Skn-1 motif、TCT-motif; 其次，还有多种激素应答作用元件，如：参与脱落酸反应的顺式作用元件ABRE(1个)，参与赤霉素反应的顺式作用元件GARE-motif(1个)，参与乙烯反应的顺式作用元件ERE(1个)。

值得注意的是，天宝蕉HOS1启动子含有一些与非生物胁迫有关的顺式作用元件，如参与低温胁迫的LTR顺式作用元件(1个)、参与热胁迫的HSE顺式作用元件(3个)以及参与干旱诱导的MYB绑定位点MBS顺式作用元件(1个)。

另外还有参与生物钟反应(circadian)、参与胚乳表达(SKN-1 motif)、参与玉米蛋白代谢作用(O2-site)、参与特异分生组织表达(CCGTCC box)、真菌诱导子响应(Box-W1)、MYBHv1绑定位点(CCAAT-box)和一些未知的顺式作用元件。

2.4 天宝蕉HOS1启动子CpG岛的预测

利用在线预测软件CpG Islands预测天宝蕉HOS1启动子序列的CpG岛，设定预测条件为：间隔至少100 bp，其中GC所占的比例超过50%，且CpG的实际值/期望值大于0.6。预测结果表明，天宝蕉HOS1启动子序列有2个CpG岛分布区域：第1个CpG岛分布区域为-1 023～1 126 bp，大小为104 bp。第2个CpG岛分布区域为-1 186～1 525 bp，大小为340 bp(图4)。

3 讨 论

3.1 天宝蕉HOS1启动子含有种类繁多的顺式作用元件

启动子预测分析表明，天宝蕉HOS1启动子共含有35种类型的顺式作用元件，意味着HOS1具有复杂的表达调控机制。这些顺式作用元件与相应的转录因子结合，发挥着多种功能。其中光响应顺式作用元件最多，达到10种。此外，还含有多种激素响应顺式作用元件，和一些其他的顺式作用元件。值得注意的是，天宝蕉HOS1启动子含有低温、热胁迫和干旱诱导的非生物胁迫顺式作用元件，这说明HOS1在植物应答非生物胁迫的时候，具有潜在的重要作用，这也佐证了拟南芥中HOS1在CBF抗寒途径中的负调控作用[13]。至于HOS1启动子中参与低温胁迫的LTR顺式作用元件在CBF抗寒途径中发挥负调控作用的具体机制，有待进一步的研究。

3.2 天宝蕉HOS1含有的多种激素应答作用元件为提高抗寒能力提供了新的线索

天宝蕉HOS1启动子含有多个激素(赤霉素、脱落酸、乙烯)响应顺式作用元件，激素与植物低温适应性关系密切，且已经在很多植物中报道了这些激素与提高植物抗寒性的关系[17-21]。预测分析结果显示，天宝蕉HOS1启动子含有多个激素响应顺式作用元件，已有的报道指出外源施加赤霉素、ABA和乙烯利能提高植物的抗寒性。但外源施加激素在栽培香蕉上的研究很少，本研究预测到天宝蕉的HOS1启动子中含有这些激素响应顺式作用元件，暗示可能通过外源施加激素来提高天宝蕉的抗寒性。

3.3 天宝蕉HOS1的冷胁迫应答可能与甲基化过程有密切关系

DNA甲基化在植物生长发育过程中起着重要的作用[21-22]。DNA甲基化主要发生在 CpG 双核苷酸序列中的胞嘧啶上[23]。DNA甲基化水平也决定着基因的表达，高水平的甲基化会抑制基因的表达，低水平的甲基化会增强基因的表达[24]。DNA甲基化除了在植物生长发育过程中的作用，还参与了植物各种逆境胁迫应答过程，调控植物逆境应答基因的表达，进而提高当代植物对逆境的适应能力[25-27]。经历胁迫的植物，其后代抗胁迫的能力将增强，也会增强对其他胁迫的交叉抗性[28-29]，即使在没有胁迫的条件下，其后代的基因组整体依然表现为超甲基化状态[30]。非生物的逆境胁迫，如盐、干旱、热、抗生素等，都会引起甲基化水平的改变[22]。

生物信息学预测结果表明，天宝蕉HOS1启动子含有2个CpG岛。拟南芥中CBF抗寒途径中HOS1起着负调控的作用，如果将HOS1启动子5端甲基化将会引起转录水平的沉默，理论上将能提高植株的抗寒性，在具体应用上有待我们进一步验证。天宝蕉HOS1启动子中含有多个非生物胁迫的顺式作用元件，这都有可能引起HOS1甲基化水平的改变，也进一步影响着基因的表达。

在植物CBF抗寒途径中，ICE1蛋白的转录活性受翻译后修饰的严谨调控，主要包括SIZ1介导的 SUMO化修饰和HOS1介导的泛素化修饰。有研究表明，降低组蛋白H2B的泛素化水平会引起H3出现低水平的甲基化[31]。哺乳动物中，组蛋白H2B泛素化对H3K4和H3K79的甲基化是必需的，且与H3K79的甲基化呈现负相关[32]。在CBF抗寒途径中，HOS1介导的ICE1泛素化修饰与ICE1的 DNA甲基化之间是一种抑制关系还是一种正相关关系有待于进一步研究。或许组蛋白泛素化与DNA甲基化之间复杂的关系对相关基因的活性的调节可能将会解释更多现在无法解释的现象。

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(责任编辑：柯文辉)

Cloning and Bioinformatic Analysis ofHOS1 Promoter from the ‘Tianbao’ Banana (Musaacuminata. AAA group)

LIU Wei-hua, LIN Zheng-chun, FENG Xin, LAI Zhong-xiong*

(InstituteofHorticulturalBiotechnology,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

In this experiment，HOS1 promoter was cloned successfully from the ‘Tianbao’ banana, and was further bioinformatically predicted. The analysis results showed that the sequence similarity ofHOS1 promoter was 92.43% between the Tianbao banana and the wild banana in Malaysia, and the Tianbao banana promoter contained 35 kinds of cis-elements, including a variety of types of phytohormone response cis-elements and cis-elements concerning abiotic stress, which suggested that there be a close relationship with cold stress response in Tianbao banana. Tianbao bananaHOS1 promoter contained two CpG islands, which suggested it should also have a close relationship between cold stress response and methylation in Tianbao banana.

‘Tianbao’banana (Musaspp., AAA group)；HOS1；promoter；cloning；bioinformatic analysis

2016-05-10初稿；2016-07-15修改稿

刘炜婳(1986-)，女，博士生，研究方向：园艺植物生物技术

*通讯作者：赖钟雄(1966-)，男，博士，研究员，研究方向：园艺植物分子生物学(E-mail:Laizx01@163.com)

福建省重大科技专项(2015NZ0002-1)；国家香蕉产业技术体系专项(CARS-32-11)

S 668.1

A

1008-0384(2016)08-820-06

刘炜婳，林争春，冯新，等.天宝蕉HOS1基因启动子克隆及生物信息学分析[J].福建农业学报，2016，31(8)：820-825.

LIU W-H，LIN Z-C，FENG X，et al.Cloning and Bioinformatic Analysis ofHOS1 Promoter from the ‘Tianbao’ Banana (Musaacuminata. AAA group) [J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：820-825.