高效液相色谱法检测土壤中氧化乐果残留

李若云，张 娇*

(1.青岛农业大学资源与环境学院，山东 青岛 266109；2.青岛市农村环境工程研究中心，山东 青岛 266109)



高效液相色谱法检测土壤中氧化乐果残留

李若云1，2，张 娇1，2*

(1.青岛农业大学资源与环境学院，山东 青岛 266109；2.青岛市农村环境工程研究中心，山东 青岛 266109)

采用高效液相色谱法优化了土壤中的氧化乐果残留测定条件，优化结果为：色谱柱为Inertsil QDS-SP 4.6*250 mm，流动相为甲醇/水(V/V=10/90)，溶剂为超纯水，检测波长210 nm，柱温25℃，进样量为20 μL，总流速1.0 mL·min-1；氧化乐果在0.1～10.0 μg·mL-1范围内，其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系(R2=0.9992)，最低检测限0.1 μg·mL-1。采用振荡提取法，提取剂为丙酮和乙酸乙酯，提取后的溶液以弗罗里硅土为固相萃取柱，淋洗剂为丙酮/乙腈(1/3)。采用上述方法对土壤样品进行测定，加标回收率为在70%～120%，相对标准偏差在2.08%～8.08%，说明该方法的准确度和精密度均符合农药残留分析的要求，适合土壤中氧化乐果的残留量检测。

高效液相色谱；氧化乐果；土壤；有机磷农药

氧化乐果学名O，O-二甲基-S-[2-(甲胺基)-2-氧代乙基]硫代磷酸酯，是我国常用的农药之一，其毒性强[1]，对害虫和螨类有很强的触杀作用，主要用于防治香蕉、棉花及果树的多种蚜虫、卷叶虫、斜纹夜蛾等害虫[2]。施用的农药60%～70%都进入土壤环境[3]。目前氧化乐果在果蔬生产上已被禁止使用[4]，但仍有地方违反规定继续使用，加之大量农药使用导致其较长时间的残存[5]，在土壤、水、果蔬中仍能检出[6]，对土壤生态系统乃至人体健康有很大危害。因此针对土壤中氧化乐果建立准确、完全系统的检测方法是具有重要意义的。

已报道的氧化乐果检测方法有毛细管电泳法[7]、气相色谱法[8]、高效液相色谱法[9-10]、TLCS法[11]和酶联免疫法[12-13]等。气相色谱法在氧化乐果的测定中应用较多，但是氧化乐果的热稳定性差[14]。高效液相色谱法以其分离效能高、检测灵敏度高、分析速度快等特点被广泛应用于有机农药的检测过程中。目前，研究者关于液相色谱法测定氧化乐果的研究，主要集中生物样品[15]、食品[16]等氧化乐果残留的检测，关于土壤样品中氧化乐果的检测主要针对多种农药同时检测[18]，由于氧化乐果极性较强，与其他农药相比，其检测回收率普遍较低。此外，研究条件的改善使得早期研究成果逐渐不适合当前研究且资料报道不详等，使得土壤中氧化乐果的检测仍存在许多问题，因此，本研究在已有基础上对高效液相色谱测定土壤中氧化乐果的方法进行验证和优化，分析试验过程中的问题，为研究者快速、准确地掌握氧化乐果检测方法提供借鉴，为土壤中氧化乐果的检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要仪器 LC-20A高效液相色谱(日本岛津公司)，Inertsil QDS-SP 色谱柱(4.6×250 mm)；SHZ-82恒温振荡器(金坛市精达仪器制造厂)；RE-52A旋转蒸发仪器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-III 循环水式真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；万分之一 电子分析天平[丹佛仪器(北京)有限公司]；GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；KQ-600B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.1.2 药品及试剂 氧化乐果标准品100 μg·mL-1(美国Accustandard公司)，甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷、乙腈均为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司)，乙酸乙酯、中性氧化铝、硅藻土均为分析纯，超纯水(屈臣氏)，硅酸镁吸附剂(60～100目)，无水硫酸钠(优级纯)。中性氧化铝和无水硫酸钠使用前450℃灼烧4 h，硅酸镁吸附剂使用前650℃灼烧4 h，置于干燥的器皿中密封备用。

1.2 试验方法

1.2.1 高效液相色谱条件的优化 在流动相、波长、溶剂、柱温、洗脱方式等方面对液相色谱测定条件进行了优化。其中波长选择210 nm和220 nm，流动相选择乙腈/水(6/94，V/V)和甲醇/水(10/9)，柱温对25、30、35、40℃进行优化，样品溶剂选择乙腈和纯水，在流速为1.0 mL·min-1，进样量为20 μL，采用等度洗脱方式下，获取优化色谱条件。

1.2.2 标准曲线的制作 吸取氧化乐果标准品用超纯水逐级稀释配成质量浓度为10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 μg·mL-1的标准工作液。

分别吸取1.5 mL质量浓度为10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 μg·mL-1的标准工作液于液相小瓶中，置于高效液相色谱仪上测定。以氧化乐果峰面积为纵坐标，进样标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立线性方程。

1.2.3 样品的提取 将供试土壤自然风干，研磨后过100 目筛。称取10.00 g土壤样品置于250 mL的具塞锥形瓶中，加入1.0 μg·mL-1的氧化乐果标准溶液1.5 mL，并设置不添加农药但添加1.5 mL超纯水的为空白对照，加入50 mL丙酮提取剂震荡50 min，再加入50 mL乙酸乙酯提取剂振荡50 min，抽滤(砂芯漏斗上铺1层硅藻土)，用15 mL丙酮和乙酸乙酯1∶1混合提取剂淋洗瓶及残渣3～5次，合并滤液后40℃水浴中旋转蒸发仪上浓缩至近干，用1 mL色谱纯乙腈溶解，待净化。

1.2.4 样品的净化 选取硅酸镁吸附剂和中性氧化铝两种常用的固相萃取小柱富集氧化乐果，以丙酮和二氯甲烷(体积比1∶1)、丙酮和正己烷(体积比3∶1)、丙酮和乙腈(体积比1∶3)3种混合试剂作为淋洗剂，选取最佳的净化条件。用丙酮和二氯甲烷的混合液(体积比1∶1)活化萃取柱，弃去淋洗液，加入1 μg·mL-1的氧化乐果标准溶液1.5 mL，分别用15 mL 3种淋洗剂分3次对样品进行洗脱，再用30 mL淋洗剂淋洗净化柱，收集淋出液，在40℃水浴中旋转蒸发仪上浓缩至近干，用超纯水定容至1.5 mL，过有机系0.22 μm的滤膜至样品瓶，供高效液相色谱测定，并计算氧化乐果回收率。

1.2.5 方法回收率测定 称取10.00 g梨园风沙土和莱阳褐土样品置于250 mL具塞锥形瓶中，在每种土样中分别加入1.5 mL 5.0、1.0、0.5 μg·mL-1的氧化乐果标准品，每个样品重复8次，每个土壤设置1个添加1.5 mL超纯水不添加农药的为空白对照。将土样用相同的提取条件、净化条件和液相色谱检测条件进行处理，分析数据并计算方法回收率。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

根据氧化乐果性质，结合文献[19-21]，在流动相、波长、溶剂、柱温、洗脱方式等方面对液相色谱测定条件进行了优化。试验结果表明，文献[19-20]给出的波长和柱温条件均具有较好的检测效果，相比较而言，波长在210 nm时峰形略好，柱温在25℃时氧化乐果峰形对称，分离效果略好。

在流动相和样品溶剂选择上，试验结果与报道[19，21]有所不同，其中乙腈/水(10/90，V/V)为流动相时峰保留时间为2.5 min左右，这个时间出峰，周围干扰峰较大，并且氧化乐果峰形较小，难于满足实际检测结果的要求，相比以甲醇/水(V/V)=10/90做流动相，农药氧化乐果在9 min左右出峰，标准溶液无干扰峰，且基线平稳，“峰形对称”，满足分析要求，可见乙腈/水不适合作为氧化乐果液相检测的流动相；此外，样品溶剂的研究结果与报道[9，21]给出的条件不同，选用乙腈[19]为溶剂时，无论如何改变液相色谱条件，乙腈的出峰条件和分离效果均不好。以水[22]为溶剂时，氧化乐果的峰形较好，基线平稳，分离效果佳，可见，水更适合作为氧化乐果样品的溶剂，而乙腈不适合。综上，最终确定以Inertsil QDS-SP 4.6*250 mm为色谱柱，高效液相色谱测定氧化乐果最佳色谱条件为流动相为甲醇/水(V/V=10/90)，溶剂为超纯水，检测波长210 nm，柱温25℃，进样量为20 μL，总流速1.0 mL·min-1。在最佳条件下氧化乐果的高效液相色谱图如图1所示，此时，氧化乐果峰形和分离效果较好，色谱图基线平稳。

2.2 标准曲线、线性范围和检出限

配制氧化乐果标准溶液，质量浓度梯度为10.00、5.00、1.00、0.50 、0.20、0.10 μg·mL-1，按照已优化的色谱条件对标准溶液进行高效液相分析，绘制标准曲线，并计算相关系数。结果(图2)显示：氧化乐果标准品在0.10～10.00 μg·mL-1范围内线性关系良好，回归方程为：Y=13638X-578.9，R2=0.9992(>0.999)。为了进一步考查该方法的灵敏度，经该优化方法上机测定，并以3倍信噪比计算出该方法测定氧化乐果的最低检出限为0.01 μg·mL-1，表明该方法使得氧化乐果浓度与峰高在较大的浓度范围内呈现出较良好的线性相关性，符合分析精度的要求。

2.3 样品的净化条件的选择

净化条件试验结果见表1，其中以中性氧化铝为固相萃取剂时，3种淋洗剂的淋洗液均未检出氧化乐果，以弗罗里硅土为净化材料，以丙酮和乙腈为淋洗液时淋洗效果较好，达到99%，但是以丙酮和二氯甲烷、丙酮和正己烷为淋洗液时淋洗效果不好，不足50%，因此，本试验采用弗罗里硅土为净化柱，丙酮和乙腈为淋洗剂。

2.4 方法回收率及精密度

在空白土壤样品中添加标准样品的方法，利用上述优化方法进行检测，通过加标回收率和相对标准偏差的计算验证该方法的精密度和准确度。试验结果见表2。由表2可见，2种土壤氧化乐果的加标回收率各不相同，总体回收率在70%以上。其中，梨树下土添加施药量在0.5、1、5 μg·mL-1的添加回收率分别为91.2%～100.4%、83.6%～87.5%、73.0%～80.9%，相对标准偏差分别是2.03%、4.17%、4.41%，相比较低含量农药添加量的土壤回收率较高，相对标准偏差也低；莱阳褐土添加施药量在0.5、1.0、5.0 μg·mL-1的添加回收率分别为100.2%～119.8%、95.6%～100.5%、87.8%～94.5%，相对标准偏差分别是2.08%、3.59%、8.08%，不同土壤和不同农药浓度之间的回收率有些许差别，这与土壤样品的理化性质有关。如表3可知，梨树土、莱阳褐土两种土壤理化性质差别较大，莱阳褐土有机质含量较高，而梨树土阳离子交换量(CEC)较高，而这2种指标是影响土壤中有机农药提取的重要因素。总体而然，2种土壤样品的平均回收率在70%～120%，检测结果较为满意。

表1 不同层析柱和不同淋洗剂对氧化乐果回收率的比较

Table 1 Comparison of different columns and eluting agents on omethoate recovery rate

净化填料标样含量/(μg·mL-1)平均回收率/%123弗罗里硅土1.0314199.85中性氧化铝1.0---

注：1,2,3分别表示淋洗液丙酮和二氯甲烷(1∶1)、丙酮和正己烷(3∶1)、丙酮和乙腈(1∶3)，

表2 土壤样品测定的氧化乐果的重复性和回收率

表3 两种不同土壤的理化性质

3 结 论

本研究采用固相萃取-高效液相色谱法来检测土壤中氧化乐果。结果表明，采用高效液相色谱法测定氧化乐果时，色谱条件为色谱柱为Inertsil QDS-SP(4.6*250 mm)，流动相为甲醇/水(V/V)=10/90，溶剂为超纯水，检测波长为210 nm，柱温为室温25℃，氧化乐果进样量为20 μL，总流速为1.0 mL·min-1，等度洗脱；采用振荡提取方法，以丙酮和乙酸乙酯为提取剂，以弗罗里硅土为固相萃取柱、丙酮/乙腈(1/3)的淋洗剂，对土壤中氧化乐果有较好的提取和纯化效果。采样上述条件对土壤中氧化乐果进行测定时，样品加标回收率为在70%～120%，相对标准偏差在2.08%～8.08%，能够满足土壤中氧化乐果的检测要求。

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(责任编辑：林海清)

HPLC Determination of Omethoate Content in Soil

LI Ruo-yun1，2，ZHANG Jiao1，2*

(1.QingdaoEngineeringResearchCenterforRuralEnvironmentCollegeofResourceandEnvironment，Qingdao,Shandong266109，China；2.QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao,Shandong266109，China)

Testing conditions for the omethoate determination byHPLC were optimized to be: Inertsil QDS-SP (4.6*250 μm) at 25℃, an injection of 20μL methanol/water (V/V=10/90) as mobile phase ata flow rate of 1.0 mL·min-1, and the wave length of 210 nm for ultraviolet detection. A high recovery rate was achieved by using anextraction column with acetone/acetonitrile (V/V=1/3) as the eluting agent. A linear calibration curve for the omethoate concentrations in the range of 0.1-10μg·mL-1(R2=0.9992) with a minimal detection limit of 0.1 μg·mL-1was established. Acetone and ethyl acetate were used as the solvents in the oscillation extraction. The recovery rate of omethoate in the soil samples ranged from 70% to 120% with a relative deviation of 2.08%-8.08%, which was within the requirements for pesticide residue analysis. It appeared that the newly developed HPLC methodology was appropriate for detecting omethoate residues in soil.

HPLC; omethoate; soil; organophosphorus pesticides

2016-04-07初稿；2016-05-20修改稿

李若云(1990-)，女，硕士生，研究方向：土壤农药迁移转化(E-mail：ruoyun827@qq.com)

*通讯作者：张娇(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：污染物迁移及控制技术(E-mail：zhangjiao11@163.com)

国家自然科学基金项目(41301552、41201507)；青岛农业大学应用型人才培养特色名校建设工程课程建设项目(XDSJP2013037)

X 592

A

1008-0384(2016)08-881-05

李若云，张娇.高效液相色谱法检测土壤中氧化乐果残留[J].福建农业学报，2016，31(8)：881-885.

LI N-Y，ZHANG J.HPLC Determination of Omethoate Content in Soil[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：881-885.