铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因克隆及其干旱胁迫下的表达分析

常笑君,郭玉琼，王 仲，赵姗姗，朱 晨，林玉玲,2，赖钟雄,2*

(1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002； 2.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002)



铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因克隆及其干旱胁迫下的表达分析

常笑君1,郭玉琼1，王 仲1，赵姗姗1，朱 晨1，林玉玲1,2，赖钟雄1,2*

(1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002； 2.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

以铁观音茶树为试材，对其中E3泛素连接酶基因进行克隆和生物信息学分析，并采用qPCR进行不同干旱条件下的定量表达分析。研究结果表明，该序列全长为1 138 bp，开放阅读框(ORF)为810 bp，编码269个氨基酸 (GenBank 登录号KR819177)。生物信息学分析发现该铁观音茶树E3泛素连接酶基因不含跨膜结构以及信号肽，具有多个磷酸化位点，亚细胞定位于叶绿体中。经BLAST比对，该基因编码的氨基酸序列与烟草、亚麻荠、葡萄、醉蝶花、芜菁中的E3泛素连接酶基因编码的氨基酸序列分别有51%、50%、50%、50%和49%的同源性，且相关保守功能结构域翻译的蛋白质序列具有RING-finger结构，初步确定该基因为铁观音茶树的E3泛素连接酶基因。qPCR分析结果显示在不同干旱胁迫处理下铁观音茶树的E3泛素连接酶基因的表达量，与对照组相比显著增加。本研究认为铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因参与茶树抗旱响应机制。

铁观音；RING型E3泛素连接酶；基因克隆；干旱胁迫；qPCR

干旱胁迫是影响农业生产最重要的非生物胁迫之一，在茶树的不同生长发育阶段，干旱胁迫都有可能发生，并会影响茶树形态建成的每一个方面，是导致茶叶减产的最主要原因之一，严重制约茶叶生产[1-2]。随着全球气候变暖，干旱胁迫出现的频率可能会越来越高，对于茶叶产业的发展具有严重影响[3- 4]。铁观音Camelliasinensiscv. Tieguanyin原产地为中国福建省泉州市安溪县，为国家级茶树良种，是优良的育种原始材料，抗旱性较强[5]，挖掘其抗旱基因，通过育种途径提高茶树的抗旱特性具有重要意义。

研究表明，植物中RING型E3泛素连接酶涉及逆境胁迫响应中关键步骤的调控，如通过催化特定的信号蛋白水解，负调控低温胁迫信号途径；通过降低水通道蛋白的表达水平来调控干旱胁迫反应；通过调节蛋白质泛素化，负调控早期干旱胁迫下基因的表达等[6]。虽然关于茶树RING型E3泛素连接酶的研究报道很少，但其在拟南芥、水稻、烟草、辣椒等植物中已有较多研究。拟南芥的XERICO基因是最早被鉴定的涉及干旱胁迫调控的RING-finger类型E3泛素连接酶基因，XERICO过表达时，植物对干旱胁迫的耐受性明显增强，且ABA含量升高，表明该基因可能通过调控ABA的生物合成量，正调控植物的干旱胁迫反应过程[7]。Zhang等[8]研究发现拟南芥中的RING型E3泛素连接酶通过介导ABA信号传导过程正调控干旱胁迫响应机制。Gao等[9]研究发现水稻中的RING型E3泛素连接酶在干旱条件下可能通过增加气孔关闭的比例，使叶片失水率下降，从而提高植物的抗旱能力。Liu等[10]研究发现，RING型E3泛素连接酶基因在烟草中异源过表达时，植物体对于干旱的耐受性显著增强。Hong等[11]研究发现辣椒中的RING型E3泛素连接酶可能也是通过ABA信号传导途径正调控干旱胁迫响应机制。

E3泛素连接酶对于研究茶树抗旱机理具有很重要的研究价值, 在茶树中的相关研究较少。本研究以铁观音茶树为试验材料，通过同源克隆及RACE技术获得铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因序列全长及ORF，对其进行生物信息学分析，并通过qPCR对该基因在不同干旱程度下的表达模式进行分析，以期为茶叶抗旱研究和育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

乌龙茶特色茶树品种铁观音。试验选用盆栽土培法[12]，于2013年4月选择长势较为一致的1年生铁观音无性系茶苗，培养于盆高及口径均为24.5 cm的塑料盆中，培养土壤为福建农林大学南区教学实践茶园土壤，该土壤为红壤，pH测定显示其弱酸性，田间持水量为23.95%。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理 干旱胁迫试验于2013年10月在福建农林大学园艺学院设施农业与科学温室中完成，试验设计处理见表1，每个处理重复10次。

表1 干旱胁迫试验处理

待土壤含水量自然消耗达到设定标准后, 每天17: 00用感量为1 g的电子计重器称盆的重量，采用补水法控制土壤含水量，在设定范围内持续处理10 d后，选取长势良好的新梢一、二、三叶位的幼嫩叶片进行混样处理。不同干旱胁迫条件处理后的叶片材料置于密封袋中，经过液氮处理，放在-80℃冰箱中保存备用。

1.2.3 基因克隆 在GenBank数据库中检索已克隆的RING型E3泛素连接酶基因序列，根据同源克隆的原则，利用DNAMAN6.0软件设计保守区的上下游引物，以cDNA为模板进行RT-PCR扩增。根据RING型E3泛素连接酶基因保守区序列及已登录的其他物种的序列，选择具有差异的区域设计3′-RACE和5′-RACE的特异性上游引物，下游引物为Clontech公司提供的RACE cDNA Amplification Kit混合引物，以cDNA为模板采用巢式PCR分别扩增出该基因的3′和5′端序列。将获得的3′、5′端序列和保守序列拼接，得到铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因全长。根据起始子处设计上游引物为:5′-CTA CCA TCC CAG AAG AAG AAG AAT GT-3′，根据终止子处设计下游引物为:5′-CAT CAA GCA TCA CAG TAT CAC CAT C-3′，用于验证RING型E3泛素连接酶基因ORF的cDNA序列。PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测后，按照TaKaRa公司的琼脂糖凝胶产物纯化试剂盒说明书介绍的步骤回收目的条带，连接到pMD-18T载体，转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞后培养，挑选阳性克隆子，进行PCR扩增鉴定，并将具有相应目的条带的菌液委托铂尚生物技术(上海)有限公司测序。

1.2.4 生物信息学分析 铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因序列及其编码的氨基酸序列同源性分析在NCBI用Blastp比对完成。编码蛋白质的基本理化性质预测利用ExPASy Protparam分析完成；蛋白质结构功能域预测通过SMART分析完成；通过NCBI Conserved Domain Search进行保守结构域预测；蛋白质跨膜区段预测通过EMBnet TMpred分析完成；蛋白质信号肽及其断裂位点与亚细胞定位情况预测分别通过SignalP 4.1Server和PSORT分析完成；蛋白磷酸化位点预测通过NetPhos 2.0分析完成；蛋白质二级结构和三维结构预测分别通过PredictProtein和SWISS-MODEL在线工具分析完成；蛋白质同源性分析通过DNAMAN软件多序列比对完成；根据NCBI其他物种同源氨基酸序列，运用MEGA6.0.6邻位归并法(NJ)构建铁观音茶树RING型E3泛素连接酶系统进化树。

2 结果与分析

2.1 RING型E3泛素连接酶基因克隆

以铁观音茶树叶片合成的cDNA为模板进行扩增，获得的保守区片段与预期目的条带一致。利用合成的cDNA为模板进行3′端巢式PCR扩增， 经TA克隆，测序结果表明获得的3′端序列与保守区序列有相应的重复片段，为铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因的3′端序列。以铁观音茶树叶片cDNA为模板进行5′端巢式PCR扩增，测序结果显示得到的序列与保守区序列有重复片段。在序列全长扩增反应中，以铁观音茶树叶片cDNA为模板扩增得到约1 000 bp的条带(图1)。分析获得的铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因序列(GenBank登录号KR819177)及其编码的氨基酸序列(图2)，表明该基因核苷酸序列全长为1 138 bp，开放阅读框(ORF)为810 bp，共编码269个氨基酸。

2.2 RING型E3泛素连接酶基因编码的蛋白质生物信息学分析

通过生物信息学在线软件对该蛋白质序列基本理化性质分析结果表明，其分子量为29.3 kD，理论等电点pI=5.96，原子组成为C1260H1988N368O402S18，总原子个数为4 036，带负电的氨基酸(Asp + Glu)28个，带正电的氨基酸(Arg + Lys)23个，总平均亲水性为-0.319，说明该蛋白为亲水酸性蛋白。通过蛋白质的结构功能域和NCBI Conserved Domain Search保守结构域预测发现 ：在这个含有269个氨基酸的蛋白质序列中，122～166位之间为RING-finger结构区域(图3)，这是RING型E3泛素连接酶基因的主要功能区域，也是该基因的重要组成部分，E3泛素连接酶活性是RING-finger结构区域的本质特征[16]，且含有APC11、COG5540、zf-rbx1等与RING型E3泛素连接酶有关的功能位点，由此判断该蛋白具有E3泛素连接酶活性。通过EMBnet TMpred程序预测铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因编码的蛋白质跨膜区段(图4)，表明RING型E3蛋白质从内到外的跨膜区域主要有1个，处于233～252位，分值为631；从外到内的跨膜区域主要有1个，处于103～125位，分值为 343，由此可以初步推断该蛋白质可能存在跨膜结构域，属跨膜蛋白，存在于细胞内。亚细胞定位预测结果显示，该蛋白质定位于叶绿体基质、类囊体膜、类囊体的空间的分值分别为0.859、0.411、0.346，表明其很有可能位于叶绿体中,进一步分析表明该蛋白不含信号肽。蛋白质磷酸化修饰是一种蛋白质翻译后共价修饰方式，蛋白质的磷酸化和去磷酸化在基因转录、植物的发育和代谢调控中起着重要的作用，能调节转录因子的转录激活或改变蛋白质的功能及其结合DNA的能力[17]。蛋白质磷酸化位点分析结果表明共有15个磷酸位点，磷酸化作用对其功能的正常发挥具有重要调控作用。Predictprotein蛋白质二级结构预测表明，该蛋白质环状、螺旋和链状结构分别占比86.99%、9.67%和3.35%，其中α-螺旋和β-折叠分别为45%和5%，裸露部分、隐藏部分和中间结构分别为77.32%、19.33%和3.35%；为了能够更加直观地了解铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因编码的蛋白质构造，通过SWISS-MODEL在线工具对其进行蛋白质三维结构预测，发现与智人的E3泛素连接酶praja-1(PDB:210b.1)相似度为41.79%(图5)。

将铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因编码的氨基酸序列与GenBank中的序列进行同源性比较，利用DNAMAN进行多重比对分析(图6)，表明该基因编码的氨基酸序列与烟草、亚麻荠、葡萄、醉蝶花、芜菁中E3泛素连接酶基因编码的氨基酸序列的相似性分别为51%、50%、50%、50%、49%。根据MEGA6.0.6邻近归并法构建该RING型E3泛素连接酶系统进化树(图7)，结果显示不同物种RING型E3泛素连接酶主要分为两大类，铁观音茶树RING型E3泛素连接酶与香瓜Cucumismelo和刺苞菜蓟Cynaracardunculusvar.scolymus等保持较近的进化距离，与美花烟草Nicotianasylvestris、茸毛烟草Nicotianasylvestris和胡杨Populuseuphratica等亲缘关系较远。

2.4 RING型E3泛素连接酶基因在干旱胁迫下表达的qPCR分析

对铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因在不同干旱胁迫处理的表达进行qPCR检测(图8)，结果显示该基因在轻度干旱T1、中度干旱T2 、重度干旱T3三个干旱胁迫处理的表达量分别是对照CK的2.157、 2.571和 2.605 倍。铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因的表达量在面临干旱胁迫时显著增加，且随着干旱胁迫程度的加深而逐渐上调，表明干旱胁迫激发了铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因的正反馈表达；在不同干旱程度下该基因表达量间的差异并不是十分显著，表明其在干旱胁迫形成后表达较稳定。因此该基因很可能参与铁观音茶树的干旱胁迫响应机制，并在干旱期发挥着重要的调控作用。

3 讨论与结论

泛素化是一种翻译后修饰过程，在植物体内调节多种重要的生理进程，如生物和非生物胁迫响应、细胞周期进程以及亚细胞定位[16-17]。其中E3泛素连接酶在蛋白质降解过程中决定靶蛋白的特异性识别，进而决定了反应的特异性，具有十分重要的作用[18]。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR方法克隆了铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因，生物信息学分析发现该基因定位于细胞质中的叶绿体，翻译的蛋白质理论等电点pI=5.96，属跨膜蛋白，且含有多个磷酸化位点，可能在植物的生长发育、代谢调控等过程中起着重要的作用。

通过泛素系统降解蛋白质是植物在许多胁迫通路信号中一个十分重要的步骤，其中包含RING指结构域的E3泛素连接酶不仅参与生长和发育进程，而且监管非生物胁迫响应机制，尤其是在植物遭受干旱胁迫时发挥着重要作用[1, 19]。本研究qPCR分析结果表明，铁观音茶树RING型E3泛素连该基因很可能参与铁观音茶树的干旱胁迫响应机制，并在干旱期发挥着重要的调控作用。Yang等[20]将RING型E3基因AtAIRP4在拟南芥中超表达，发现种子萌发期间对渗透压极为敏感，与ABA和干旱相关的标记基因表达水平提高，结果表明该基因可能通过调节ABA信号通路控制气孔运动来积极响应干旱胁迫。范锡麟等[21]研究发现水稻RING型E3基因OsRING6可能在盐胁迫中作为早期响应基因起调控作用，并参与干旱胁迫和调节ABA信号传导途径。脱落酸(abscisic acid，ABA)被称为植物的“胁迫激素”， 主要于叶绿体中合成，转移至其他组织中积累，在植物干旱、高盐、低温等逆境胁迫反应中起重要作用[22-24]。脱落酸、生长素和赤霉素等多种植物激素信号之间具有相互调控的作用，这种响应机制在茶树[25]和龙眼[26]等植物中已被证实。铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因亚细胞定位于叶绿体中，并在干旱胁迫下表达量显著增加，结果表明该基因很可能介导ABA信号传导途径，与其他植物激素互相作用，通过控制气孔开闭，减少叶片水分蒸发，降低叶片细胞膜透性等途径降低叶片的失水率，增强茶树的抗氧化能力，进而提高植株的抗旱性。

抗逆性对于茶树的生长发育十分重要，本研究采用RT-PCR和RACE方法从铁观音茶树中克隆得到RING型E3泛素连接酶基因，综合分析了该基因在茶树抗旱方面发挥的重要作用，这种调控机制有待遗传转化进一步验证，该基因在逆境胁迫抵御方面的作用机制，非生物胁迫如抗寒[27]、耐盐[28]等，生物胁迫如抗病[29-30]等，有待进一步研究。

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(责任编辑：林海清)

Cloning and Expression Analysis of Ring-type E3 Ubiquitin Ligase Gene inCamelliasinensiscv.Tieguanyin Under Drought Stress

CHANG Xiao-jun1，GUO Yu-qiong1，WANG Zhong1，ZHAO Shan-shan1，ZHU Chen1，LIN Yu-ling1,2，LAI Zhong-xiong1,2*

(1.CollegeofHorticulture,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuhou,Fujian350002,China；2.InstituteofHorticulturalBiotechnology,FujianAgricultureandForestyUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

The E3 ubiquitin ligase gene fromCamelliasinensiscv.Tieguanyin tea plants were cloned and subjected to a bioinformatics analysis. Under varied drought conditions on the plants,the quantitative expressions of the gene was determined using qPCR. The gene sequence (GenBank accession number, KR819177) was found to be 1 138 bp long containing an open reading frame (ORF) of 810 bp and encoding 269 amino acids. The bioinformatics revealed that the ligase gene did not have a transmembrane or signal peptide but multiple phosphorylation sites, and that its subcellular cells located in the chloroplasts. Its nucleotide and deduced amino acid sequences showed 51%, 50%, 50%, 50%, and 49% homology with the E3 ubiquitin ligase genes fromNicotianasylvestris,Camelinasativa,Vitisvinifera,Tarenayahassleriana, andBrassicarapa, respectively;while its conserved functional domains related to the translated protein sequences had a RING-finger structure. Consequently, it was preliminarily identified as the E3 ubiquitin ligase gene ofC.sinensiscv. Tieguanyin. Subsequently, the qPCR analysis indicated that the transcript of this gene,when the tea plant was under varied drought stresses, was significantly more up-regulated than control. Hence, it was concluded that the previously identified RING-type E3 ubiquitin ligase gene found inC.sinensiscv. Tieguanyin indeed involved in the drought response mechanism of the plant.

Camelliasinensiscv. tieguanyin; RING-type E3 ubiquitin ligase; gene cloning; drought stress; qPCR

2016-04-18初稿；2016-05-22修改稿

常笑君(1992-)，女，硕士生，研究方向：茶树种质资源创新与利用(E-mail:986071216@qq.com)

并列第一作者：郭玉琼(1974-)，女，副教授，博士，研究方向：茶树生物技术与茶叶生物化学(E-mail: guoyq828@163.com)

福建省自然科学基金(2013J01085)；福建省重大科技专项(2015NZ0002-1)；福建省教育厅项目(JA15143)

S 571.1

A

1008-0384(2016)08-826-07

常笑君，郭玉琼，王仲，等.铁观音茶树RING型E3泛素连接酶基因克隆及其干旱胁迫下的表达分析[J].福建农业学报，2016，31(8)：826-832.

CHANG X-J，GUO Y-Q，WANG Z，et al.Cloning and Expression Analysis of Ring-type E3 Ubiquitin Ligase Gene inCamelliasinensiscv. Tieguanyin Under Drought Stress[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：826-832.

*通讯作者：赖钟雄(1966-)男，博士，教授，博士生导师，主要从事园艺植物分子生物学研究(E-mail: laizx01@163.com)