莲瓣兰大雪素AP1 MADS-box基因的克隆和系统发育分析

， ， ， (云南农业大学作物种质创新与可持续利用重点实验室和工程中心， 昆明 650201)

莲瓣兰大雪素AP1 MADS-box基因的克隆和系统发育分析

刘涛，普卫琼，赵银河，于仲艳
(云南农业大学作物种质创新与可持续利用重点实验室和工程中心， 昆明 650201)

随着植物中越来越多的MADS-box基因被克隆出来，人们对经典的ABC模型进行了改进和完善，提出花发育的ABCDE模型，通过RT-PCR和RACE技术从莲瓣兰大雪素花器官中克隆得到AP1同源基因AP1a和AP1b的cDNA全长：AP1a基因全长为1 054 bp，其开放阅读框为744 bp；AP1b基因全长为944 bp，其开放阅读框为516 bp。从莲瓣兰大雪素中得到2个AP1同源基因，说明在大雪素中AP1出现基因松弛，所以出现多个拷贝。通过序列比对以及系统发育分析表明，莲瓣兰AP1a基因与春兰具有很高的相似度，达到99.1%，莲瓣兰AP1b基因与萼脊兰具有中等程度的相似度，达75.8%，但从大雪素花器官提取的同源基因AP1a和AP1b的相似度很低，仅为65.4%。这表明AP1基因在不同品种植物间具有保守性，而在同一个物种中又存在着功能的分化。

莲瓣兰大雪素；AP1基因； 克隆； 系统发育分析

全球开花植物已知有25 000多种，在陆地生态系统中占有明显的优势。开花是高等植物从营养生长转向生殖生长的一个重要的生理过程, 开花既受外界环境因素的影响, 又受内在基因的调控。研究发现，MADS-box基因在花发育过程中起着重要作用[1]。

随着花器官发育研究的深入,有关花器官发育相关基因的研究已取得了很大的进展。这些双子叶植物的花由同心圆的四轮结构组成，从外向内依次为：第1轮萼片，第2轮花瓣，第3轮雄蕊，第4轮心皮[2]。按照变异器官分布的空间顺序，这些突变体分为3类：第1类突变体的萼片转化为心皮，花瓣转化为雄蕊，导致花的组成由外至内依次为心皮-雄蕊-雄蕊-心皮；第2类突变体将花瓣转化为萼片，雄蕊转化为心皮，花组成为萼片-萼片-心皮-心皮；第3类突变体雄蕊转化为花瓣，心皮转化为类似萼片的结构，花组成为萼片-花瓣-花瓣-萼片，并且在心皮内不断产生不确定的花器官，这些花器官类似于萼片与花瓣组织[3-6]。

在拟南芥中,A类基因有2 个,APETALA1(AP1)和AP2,其中AP1有2 个旁系同源基因, 分别为CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL)；B类基因2个,APETALA3(AP3)和PISTILLATA(PI)；C类基因主要是AGAMOUS(AG),它有3 个旁系同源基因SEEDSTICK(STK),SHATTERPROOF1 (SHP1)和SHP2；E类基因有4 个,SEPALLATA1 (SEP1),SEP2,SEP3,SEP4[3]。除AP2外, 这些基因都为一类结构上非常保守的Ⅱ型MADS-box基因[2]。AP1基因属于花分生组织特征基因，调控花序分生组织向花分生组织的转变。

莲瓣兰(Cymbidiumtortisepalum)是中国春兰的一个新品系， 大雪素滇兰为四大名品之首，宽叶莲瓣素白花素心品种。俗称大素心，已有数百年的栽培历史，原产于滇西的部分地区[7]。本研究以莲瓣兰大雪素做实验材料，用RACE方法快速地克隆全长cDNA，从花的器官材料中分离开花相关SEP1基因并进行克隆。通过对莲瓣兰大雪素AP1基因的初步研究，了解AP1基因是植物花器官调控途径的一个重要因子。

1 材料与方法

1.1 材 料

所采用材料为莲瓣兰大雪素(Cymbidiumtortisepalum)，是中国兰花中的优秀品种，也是滇兰莲瓣兰中的一颗明珠，是莲瓣兰中的优秀代表品种[7]。它盛开在元旦春节，花枝高挺出架，花朵洁白，具有暗香。

1.2 必要培养液的配置

200 mL LB培养液的配制：2 g胰蛋白胨、1 g酵母提取物、1 g NaCl(pH=7)，若配制固体培养基则加3 g琼脂。

1.3 实验设备

计算机、PCR仪、电泳槽、离心机、振荡床、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、灭菌锅、烘箱、移液设备、容器、刮子等。

1.4 RNA的提取

选用TransZol Plant(TransGen Biotech，Beijing，code#ET 121-01)提取大雪素花器官的RNA，严格按照试剂盒进行。

1.5 特异性引物设计

3′-RACE CDC Primer

5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3

AP 1-F 5- CAACACTTTACTGCCGCCA-3

AP 1-R 5- GCGAGCACAGAATTAATACG-3

1.6 cDNA的合成

按SMART RACE cDNA Amplication Kit操作流程进行。3’SMART-RACE PCR加入以下试剂于灭菌的PCR反应管中：Total RNA,2μg；10×Advantage PCR Buffer,5μL;dNTP mix(10 mmol/L),4μL;Primers (10μmol/L),各0.75μL;Advantage 2 Polymerase Mix,2μl;ddH2O 17.75μL。混合以上试剂，短暂离心，将反应管放在预热的PCR仪上，按下列程序进行循环：

35的循环，94 ℃×3 min 30 s，94 ℃×20 s,57 ℃×30 s,72 ℃×1 min，72 ℃×7 min,4 ℃×∞。

循环结束后，取5μL样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，检测合成情况。

1.7 电泳检测，割胶回收目的片段

取5μL的PCR产物进行克隆，克隆方法参照文献[8]，随机筛选白色菌落，送北京华大基因公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 RACE克隆莲瓣兰大雪素(Cymbidium tortisepalum)AP1基因的全长

用转录组测序方法获得了AP1基因的序列,在NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/database中进行功能预测是FT的 5′端序列。为了进一步研究这些基因的功能及表达特性，克隆了全长序列cDNA。对瓣兰大雪素不同发育时期的花原基、花蕾以及合蕊柱混合样品进行Total RNA的提取，琼脂糖凝胶电泳方法监测RNA的质量；以Total RNA为模板，按照RACE试剂盒的说明进行反转录后得到3′端和5′端cDNA模板, 对3′端的cDNA模板进行特异引物和Outprimer进行PCR扩增，获得3′端片段，然后5′端与3′ 端的序列进行拼接，在5′和3′端设计特异引物，再一次进行全长cDNA的克隆，对菌液PCR进行进一步的测序，获得了这个基因的全长cDNA。这个基因cDNA 全长为 662 bp, 包含有编码框,1个长为34 bp的 5′UTR和103 bp 3′UTR的非翻译区，具有完整的开放阅读框(ORF)522 bp,编码173氨基酸的蛋白质，如图1。从莲瓣兰大雪素中分离出来的FT基因。

2.2 蛋白质结构域和系统发育分析

CtAP1推定的氨基酸序列与石斛兰(DendrobiumgrexMadameThong-IN)、金钗石斛(Dendrobiumnobile),朵丽蝶兰(Doritaenopsishybridcultivar)，珍稀细茎石斛(Oncidiumhybridcultivar)和小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsisequestris)等兰花以及单子叶植物AP1早竹(原栽培型) (Phyllostachyspraecox)都具有较高的相似性，与其它单子叶植物也有一定的相似性。图2 是CtAP1 基因推定的氨基酸序列与其他物种AP1 基因的氨基酸序列比对结果，结果显示AP1 氨基酸序列的5′端保守性较高，而3′端保守性较低，这是MADS-MADS-box基因的典型特征，并在C 端存在单子叶植物APl/SQUA基因所特有的paleoAPl(LPPWML)结构域。

图1 编码氨基酸的序列

图2 AP1蛋白质结构域的比较

从图3中可以看出，用ME法对来自于莲瓣兰大雪素的AP1基因进行系统树的构建，通过系统发育重建发现，从莲瓣兰大雪素中分离出来的AP1基因与来自于兰科的石斛兰(DendrobiumgrexMadameThong-IN)、金钗石斛(Dendrobiumnobile),朵丽蝶兰(Doritaenopsishybridcultivar)，石斛兰(Dendrobiumhybridcultivar)，珍稀细茎石斛(Oncidium hybrid cultivar)以及小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris)的AP1基因具有支持率并聚为一枝，并且支持率达到99%(图3)。同时与其他兰科和单子叶植物AP1早竹(原栽培型) (Phyllostachys praecox)具有很高的支持率，达到99%(图3)。

图3 AP1 MADS-box基因的进化分析

本实验以三百草作为材料分离出AP1基因，通过RACE方法从莲瓣兰大雪素中快速分离出AP1全长cDNA，获得全长约为1 000 bp的cDNA，通过测序分析，确定该基因为AP1MADS-box的全长cDNA序列，共编码241个氨基酸。AP1基因属于花分生组织特征基因，又是花器官形态特征基因，AP1基因有促进植物开花的作用，且此作用在不同植物间具有保守性。

AP1基因在花器官发育上起关键作用。在花发育的ABCDE模型中，AP1基因属于A类基因，是萼片和花瓣正常发育所必需的[2]。通过对拟南芥和金鱼草中花的同源异型突变体的研究，Coen等[8]最早提出花器官发育的ABC模型，用于解释花的同源异型基因在器官形成中的作用。现已在拟南芥中克隆到具有A功能的基因有AP1和AP2，具 B功能的有AP3和PI，具C功能的有AG。相应在其它种类如金鱼草、烟草、西红柿、矮牵牛中亦分别克隆到类似的基因。上述所有种类中，控制同一功能的不同植物基因的功能、表达方式，所表达的氨基酸序列都具有高度的相似性[9]。

[1]马辉,张智俊,罗淑萍.植物MADS-box基因研究进展[J].生物技术通报,2006(6):14-18.

[2]Coen ES,Meyerowitz EM.The war of whorls:Genetic interactions controlling flower development[J].Nature,1991,353:31-37.

[3]Gao X,W Liang,C Yin,et al.The SEPALLATA-like gene OsMADS 34 is required for rice inflorescence and spikelet development[J].Plant Physiol,2010,153(2):728-40.

[4]Cseke LJ,SB Cseke,N Ravinder,et al.SEP-class genes in Populus tremuloides and their likely role in reproductive survival of poplar trees[J].Gene,2005,358:1-16.

[5]Shore P,SharrocksAD.The MADS-box family of transcription factors[J].Eur J Biochem,1995,229(1):1-13.

[6]丛楠,程治军,万建民.控制花器官发育的 ABCDE 模型[J].中国农学通报,2007,23(7):124-127.

[7]陈贵.云南名兰大、小雪素[J].中国花卉园艺,2001,17:45.

[8]袁秀云,蒋素华,田云芳,等.1个兰花MADS-box基因的克隆与表达分析[J].河南农业大学学报,2013,47(6):683-691.

[9]张则婷,李学宝.MADS-box基因在植物发育中的功能[J].华中师范大学植物生理学通讯,2007,43(2):198-202.

Isolation and Phylogenetic Analysis ofAP1 Gene fromCymbidiumtortisepalum

LIUTao,PUWeiqiong，ZHAOYinhe,YUZhongyan
(Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Sustainable Utilization and and Engineering Center,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

With more and more plantMADS-boxgenes have been cloned,the classic ABC model has been improved,and ABCDE model of flower development had formed.Using rapid amplification of cDNA ends (RACE) amplified the full-lenth cDNA ofAP1aandAP1b.the full lenth cDNA ofAP1awas 1 054 bp,contained one ORF(744 bp),the full lenth cDNAof AP1b was 944 bp,and it contained one ORF for 516 bp.This suggest thatAP1 shows gene loose and come out with may copy inCymbidiumtortisepalum.The phylogenetic analysis ofAP1aandAP1bgene ofCymbidiumtortisepalumshow thatAP1ainCymbidiumtortisepalumwas similar with that in Cymbidium faben with the similarity of 99.1%,howeverAP1bwas similar with sedirea japonica with the similarity of 65.4%. And the similarity betweenAP1aandAP1binCymbidiumtortisepalumwas only 65.4%.This suggests thatAP1 gene show the conservative in different plant,but it also show functional differentiation in the same species.

Cymbidiumtortisepalum;AP1 genes; clone; phylogenetic analysis

2016-01-19

国家自然科学基金(编号：NSFC 31060166 and NSFC 31460053)；云南省中青年学术技术带头人后备人才(编号：2012 HB 018)资助。

刘 涛(1978—)，男，博士，副教授，主要从事药用植物学研究。

赵银河(1967—)，女，副教授，遗传学博士，主要从事发育生物学；E-mail：yhzhao808@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.07.014

S 682.31

A

1001-4705(2016)07-0014-04