赤霉素及光照对白芨种子无菌萌发的影响

， ， ， ， 国彬(武昌理工学院生命科学学院， 湖北 武汉 430223)

赤霉素及光照对白芨种子无菌萌发的影响

代建丽，张露，郭鲜蒲，周，张国彬
(武昌理工学院生命科学学院， 湖北 武汉 430223)

以白芨蒴果为材料，采用涂布法接种白芨种子，研究植物激素和光照对白芨种子无菌萌发的影响。结果表明，种子分散良好，光照显著促进白芨种子的萌发，6-BA是影响种子萌发的主要因素，赤霉素对种子萌发作用不明显。在1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3的培养基上，白芨种子萌发率达90%，萌发时间较短，形成的幼苗健壮。

白芨种子； 萌发； 植物激素； 光照

白芨(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)为兰科白芨属多年生草本植物，其干燥块茎为中药白芨。中药白芨是《中国药典》收载品种，具有收敛止血、清热利湿、消肿生肌等功效，在我国已有上千年的药用历史。近年来的研究发现，白芨还具有抗肿瘤作用和抑菌作用。临床上白芨代血浆被用于治疗失血性休克[1]。白芨应用范围的不断扩大导致药材需求急剧扩增。由于缺乏胚乳，需要共生菌共生萌发，白芨种子在自然条件下萌发率极低[2]，自然繁殖速度缓慢，野生资源濒临灭绝。分株繁殖等传统种植方法难以满足规模栽培的需要。利用组织培养技术进行快速繁殖可为白芨的资源保护和可持续利用提供新的途径。

目前已有较多白芨离体培养的报道，假鳞茎[3]、幼根[4]、花茎[5]、侧芽[6]、蒴果[7-13]等都有用作外植体的研究。6-BA 、KT 、NAA、2，4-D是应用较多的植物激素，以6-BA 和NAA的组合应用最多，浓度范围为0～3.0 mg/L，赤霉素的使用尚无报道。研究结果一致显示，蒴果中的种子是最容易培养成功的材料。1/2 MS是最适的种子萌发基本培养基，效果优于MS、KC、VW。白芨种子萌发存在萌发周期长、萌发率相对其他种子低的现象。在种子萌发的环境条件比如光照方面已有不同研究，有些采用暗培养[7]，有些研究采用暗培养后光照培养[8]，而大部分研究采用光照培养[9-12]。为了提高白芨种子的萌发率，本试验采用赤霉素诱导白芨种子萌发，并探讨光照对白芨种子萌发的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

当年收获的白芨蒴果，种子胚龄21周，产自湖北京山。

1.2 方 法

1.2.1 白芨种子萌发培养基

表1 白芨种子萌发培养基因素和水平

水平6⁃BA(mg/L)NAA(mg/L)GA3(mg/L)10．50．50．521．01，01．0

以1/2 MS为基本培养基，以不同浓度6-BA、NAA、GA3为考察因素，进行3因素2水平正交试验，具体水平见表1。由于白芨种子细小，1个蒴果中含有数万粒种子，撒种容易导致种子堆叠，影响萌发并影响计数，为便于分散种子和后续实验观察种子萌发，采用培养皿涂布法培养白芨种子。每处理3个重复。

1.2.2 白芨种子的消毒和接种

将白芨蒴果用自来水清洗干净，再用去离子水冲洗3次，沥干。转入超净台用75%乙醇浸泡20 s，无菌水洗涤1次，再用0.1%氯化汞消毒10 min，无菌水洗涤5次，无菌滤纸吸干表面水分。用手术刀剖开蒴果，将白芨种子转入无菌的培养皿中，取出适量用于解剖观察幼胚，其余加入稀琼脂搅拌均匀，用移液枪吸取1 mL含种子的稀琼脂，加入到种子萌发培养基上，用涂布棒涂布均匀，晾干后封口。

1.2.3 培 养

将每个处理分成2组，一组放入光照培养箱，1 000 lx培养5 d后2 500 lx培养至种子萌发；另一组持续暗培养，待光照培养组全部萌发后，将一半种子转移到光下培养，另一半继续暗培养。培养后每隔2 d观察记录种子的萌发情况，30 d后统计种子萌发结果。每个培养皿中的种子数以有胚率种子计算，即培养皿中的种子数以培养皿中的实际种子数乘以90%为标准。萌发率(%)=萌发种子数/接种种子数×100%。

1.2.4 幼苗的培养

1个月后，将萌发生长良好的白芨幼苗转接到MS培养基中进行继代培养，待幼苗长到2 cm以上进行移栽。同时观察由暗培养转到光照培养的白芨种子的萌发情况。

2 结果与分析

2.1 光照对白芨种子萌发的影响

将培养皿分别放入光照培养箱和暗培养箱中进行培养，5 d后观察发现，2种白芨种子颜色变深，体积增大。1周后，光照培养的白芨种子颜色转绿，暗培养的白芨种子没有转绿(图2，图3)。2周后，光照培养的种子变大，开始萌发，而暗培养的种子变成浅黄色，未萌发(图4，图5)。3周后，光照培养的种子大部分已经萌发，暗培养的种子颜色变为褐色，未萌发。4周后，光培养种子长大，长出第2片叶(图6)，基部根毛突起明显(图7)，暗培养种子无变化(图8)。将暗培养的种子一半转入光照培养，另一半继续暗培养，2周后，转入光照培养的种子有48%左右开始萌发，暗培养的种子一直没有萌发，慢慢变成褐色。实验表明，光照促进白芨种子的萌发。

图9 5周白及幼苗继代培养

图10 5周白芨幼苗(局部)

图11 2个月的白芨幼苗

图12 2个月的白芨幼苗(局部)

2.2 激素对白芨种子萌发的影响

将培养皿放入光照培养箱中进行培养，1周后光照培养的白芨种子颜色转绿，2周后种子开始萌发，3周后白芨种子大部分萌发，4周后形成2片叶子，基部出现根毛。5周后将白芨幼苗转入MS培养基继代培养(图9，图10)，4周后白芨幼苗长到2 cm左右，有4片左右幼叶，具根，可以移栽(图11，图12)。不同培养基上白芨种子的萌发情况见表2。

表2 不同培养基中白芨种子的萌发率

序号NAA(mg/L)6⁃BA(mg/L)GA3(mg/L)萌发率(100%)第1次第2次第3次平均值11(0．5)1(0．5)1(0．5)74．279．076．876．7212(1．0)2(1．0)86．78287．585．432(1．0)1286．381．184．083．8422188968991Ⅰ1162．1160．5167．7Ⅱ2174．8176．4169．2k222R6．357．950．75

从表2可知，试验条件下，NAA、6-BA、GA3对白芨种子萌发率的影响由大到小依次为6-BAgt;NAAgt;GA3，GA3对白芨种子萌发无显著促进作用。在3种激素的浓度水平中，以NAA 1.0 mg/L、6-BA 1.0 mg/L、GA30.5 mg/L为最适浓度。方差分析结果表明，实验数据不符合正态分布，原因可能是实验数据较少和白芨种子的生理状态不尽相同。

3 结论与讨论

白芨种子众多，但受各种条件限制难以萌发，白芨种子萌发技术将极大的促进白芨的种质保存和资源利用。张建霞较早开始了白芨胚发育和种子萌发关系的研究，发现白芨种子的有胚率和萌发率随胚龄增大而增大，胚龄20周左右的种子最适合培养[13]。赵漫丽等研究了激素和添加剂对白芨种子萌发的影响，发现6-BA对种子萌发和原球茎增殖有较明显的促进作用[8-11]，一些添加剂如椰子汁、活性炭也具有促进作用；种子萌发一般需要20～30 d；种子萌发率较低，已报道资料中90%都在80%以下。本试验首次尝试用涂布法接种白芨种子，结果白芨种子分散良好，比播种法便于统计和观察。在种子萌发培养基中，结合6-BA和NAA首次加入了赤霉素，结果显示，6-BA是白芨种子萌发的主要影响因素，与已有研究结论相同，赤霉素对种子萌发无明显的促进作用，具体原因有待进一步研究。光照作为种子萌发的环境条件，已有的研究结果不尽相同，本试验表明，光照显著地促进白芨种子的萌发，暗培养的种子不能萌发，转入光照培养后萌发率降低，萌发时间延长。本试验中，白芨种子的萌发率较高，4个处理中一个低于80%，另外3个处理都在80%以上，可能与涂布法接种的种子数量较少、分散均匀、便于统计有关。本试验建立的方法适合白芨种子的无菌萌发。

[1]林福林,杨昌云,杨薇薇,等.中药白芨的现代研究概况[J].中国医院药学杂志,2013,33(7):571-573.

[2]郭顺星,徐锦堂.白及种子染菌萌发过程中细胞超微结构变化的研究[J].植物学报,1990,32(8):594-598.

[3]石云平,赵志国,唐凤鸾,等.白芨愈伤组织诱导、增殖与分化研究[J].中草药,2013,44(3):349-353.

[4]田英翠,袁雄强.白芨组织培养快繁技术研究[J].江苏农业科学,2006(4):75-77.

[5]邹娜,李意,连芳青.优良观赏药用地被植物——白芨组织培养及快速繁殖研究[J].江西农业大学学报,2013,35(5):950-955.

[6]石云平,李锋,凌征柱.白芨组织培养与快速繁殖技术研究[J].广西农业科学,2009,40(11):1 408-1 410.

[7]王楷,李玥,张云峰,等.白芨种子的高效萌发及其无性繁殖体系的构建[J].云南师范大学学报(自然科学版),2014,34(4):71-78.

[8]赵漫丽,黄春球,李明静,等.添加剂对白芨组培的影响[J].云南农业大学学报,2011,26(6):821-827.

[9]张燕,黎斌,李汝娟,等.白芨种子的无菌萌发过程观察和组培快繁研究[J].北方园艺,2013(3):158-160.

[10]张燕,黎斌,李思锋.不同培养基上白芨的种子萌发与幼苗形态发生[J].西北植物学报,2009,28(8):1 584-1 589.

[11]吴华芬,姚宏,刘南祥.离体培养丽水野生白芨快速繁殖[J].北方园艺,2008(6):180-182.

[12]陶刚,朱英,刘作易,等.野生黄花白芨的组织快繁及分子鉴定[J].种子,2008,27(8):22-27.

[13]张建霞,付志惠,李洪林,等.白芨胚发育与种子萌发的关系[J].亚热带植物科学,2005,34(4):32-35.

Effect of GA3and Light on the Seed Germination ofBletillastriata

DAIJianli,ZHANGLu,GUOXianpu,ZHOUZhou,ZHANGGuobin
(College of Life Science,Wuchang University of Technology,Wuhan Hubei 430223,China)

The mature capsule ofBletillastriatawas used to study the effect of GA3and light on the germination of seed.Spread-plate method was adopted to inoculate the seeds and the seeds were separated to culture under light or in darkness.Results showed that seeds were evenly distributed in the medium and had good germination rate at 90% with the medium 1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/LNAA+0.5 mg/L GA3.6-BA was the most important factor in seed germination while GA3had small effect.the germination time was short and the seedlings were strong.

Bletillastriataseed; germination; GA3; light

2016-02-22

湖北省教育厅科研项目“组培白芨及其有效成分抗肿瘤作用研究”(编号：B 2014129)。

代建丽(1978—)，女，湖北随州人；硕士，讲师，主要从事植物细胞工程方面的研究；E-mail:lilydaijl@126.com。

张国彬(1973—)，男，河南周口人；硕士，讲师，主要从事植物细胞工程方面的研究；E-mail:zhgbin_1973@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.07.018

S 567.23+9

A

1001-4705(2016)07-0018-04