响应面法优化黄浆水发酵生产单细胞蛋白的工艺参数研究

车颖洁，郝林*

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801）

响应面法优化黄浆水发酵生产单细胞蛋白的工艺参数研究

车颖洁，郝林*

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801）

以大豆黄浆水为原料，选用白地霉、扣囊拟内孢霉、解脂假丝酵母和产朊假丝酵母（2∶1∶1∶2）作为发酵菌株发酵黄浆水。在单因素试验的基础上，通过响应面设计法，对黄浆水发酵生产单细胞蛋白（SCP）的工艺进行研究。结果表明，影响SCP产量的因素大小顺序为初始pH、发酵时间、装液量；最佳发酵工艺参数为碳氮比5、初始pH 6、装液量140 mL/250 mL、接种量6%、发酵温度28℃、发酵时间42 h；经过优化后的SCP产量达到3.28 g/100 mL。

黄浆水；单细胞蛋白；响应面法；玉米淀粉水解糖

黄浆水是指从豆腐压榨到成型的过程中，为了使豆腐获得特定的含水量、弹性特征等，必须施加一定的压力把内部多余的水分通过布包排出，豆浆中的蛋白被凝固剂凝结成固体豆腐，豆腐与水分开，分离出来的压滤废水[1]。黄浆水作为豆腐加工企业的副产品，来源广泛，价格低廉，含有蛋白质、脂类、糖类、维生素、矿物质、柠檬酸、维生素、色素、可溶性固形物等，其中生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）达7 400 mg/L，化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）达10 000 mg/L，总氮和氨氮（NH3-N）也较高，不能直接排放。目前企业主要采用生化处理方式，在曝气池进行降解有机物，投资大且效率低[2]。

单细胞蛋白（single cell protein，SCP）又称微生物蛋白或菌体蛋白，是利用工业废水、天然气、农副加工产品、石油烷烃类以及有机垃圾等作为培养基，培养酵母、细菌、微型菌、真菌等单细胞生物体，然后经过净化干燥处理后制成，是食品和饲料工业重要蛋白质的来源，不仅可以作为饲料，还可以作为深加工的原料[3-4]。近年来，随着利用农副产品废料可生产SCP的报道越来越多，成为人类关注的热点。在饲料中SCP被作为一种重要的蛋白质增补剂来代替常规蛋白质。

本试验利用多种酵母及霉菌发酵黄浆水[5-7]。由于每种菌对生长繁殖条件都有不同的要求，因此，必须研究适合于混合培养的发酵条件以达到充分利用废水中有效物质的目的，在发酵SCP的同时净化废水。该文通过对初始pH、碳氮比（C/N）、接种量、发酵温度、发酵时间、装液量等影响发酵的主要因素进行研究，从而使发酵工艺得到优化。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种与原料

白地霉（GeotrichumcandidumSH501）：山西农业大学食品院微生物实验室保藏菌种；扣囊拟内孢霉（Endomycopsis fiburigerCICC31258）、解脂假丝酵母（Candida lipolyticaCICC32457）、产朊假丝酵母（Candida utilisCICC31268）：均购于中国食品发酵工业研究院；

大豆黄浆水：取自豆制品加工企业；玉米粉：市售。

1.1.2试剂

糖化酶（100 000 U）、淀粉酶（10 000 U）：江苏锐阳生物科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：天津市科密欧试剂开发中心；酒石酸钾钠：天津市登峰化学试剂厂。

1.1.3培养基

（1）麦芽糖培养基：蛋白胨10 g、麦芽糖20 g、酵母膏5 g、琼脂15 g、水1 000 mL，自然pH，在0.1 MPa、121℃条件下灭菌20 min。

（2）马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1 000 mL，煮沸30 min，双层纱布过滤，滤液中加2%葡萄糖，补充水分，加2%琼脂，自然pH，在0.075 MPa、115℃条件下灭菌30 min。

1.2仪器与设备

ZWY-2102C恒温培养振荡器：上海智诚分析仪器制造有限公司；5804R-台式离心机：上海安亭科学仪器厂；BL-58A灭菌锅：上海博迅实业有限公司；水平型超净工作台：上海力申科学仪器有限公司；BPH-9052电热恒温培养箱：北京市光明医疗仪器厂；BPH-9000电热恒温鼓风干燥箱：北京医疗设备厂；WB-200水浴锅：郑州长城科工贸有限公司。

1.3方法

1.3.1单因素发酵条件的筛选

选取初始pH、碳氮比（C/N）、接种量、发酵温度、发酵时间、装液量6个因素依次进行单因素发酵试验[8-12]。各因素的水平梯度设置分别为：初始pH值4、5、6、7、8；C/N 2.5（无外加碳源）、5、7、9、11；接种量（白地霉∶扣囊拟内孢霉∶解脂假丝酵母∶产朊假丝酵母=2∶1∶1∶2）2%、4%、6%、8%、10%；发酵时间24 h、30 h、36 h、42 h、48 h，发酵温度24℃、26℃、28℃、30℃、32℃；装液量为80mL/250mL、100mL/250mL、120 mL/250 mL、140 mL/250 mL、160 mL/250 mL。根据单因素试验结果，确定各个因素的最佳水平值，为响应面试验提供依据，以便研究发酵的最佳条件。

1.3.2C/N比的调整方法

发酵液的C/N主要通过玉米粉水解糖[13-14]作为外加碳源进行调整。玉米淀粉水解糖的制备方法为：准确称取100 g玉米粉于500 mL的烧杯中，加入200 mL蒸馏水搅拌均匀；然后按照顺序进行糊化、液化、糖化等。首先进行糊化，加入1 mL氯化钙溶液以保证Ca2+含量，用5%的碳酸钙调pH至6.2、在95℃水浴锅中糊化15 min；然后进行液化，加入1g活力为10 000 U的淀粉酶，在70℃水浴液化4～5 h，90℃灭活20 min，用碘液变褐为终点进行检测；最后糖化，在液化好的玉米粉水解液中加入1 g活力为100 000 U的糖化酶，在60℃水浴糖化8～9 h，后在80℃水浴灭活30 min，向无水乙醇中滴入糖化液1～2滴，若无白色沉淀则达到糖化终点。然后根据农业部标准用DNS法对水解糖中的还原糖进行测定，利用葡萄糖标准曲线进行计算得到玉米淀粉水解液中的还原糖含量[15-17]。

1.3.3单细胞蛋白含量的测定

经过发酵后的黄浆水在台式离心机中以4 000 r/min离心20 min，然后在70℃烘箱中烘干至质量恒定，即得SCP的质量。

1.3.4响应面法优化发酵条件[17-22]

根据响应面试验的设计要求，对单因素试验的结果进行分析，筛选出3个显著因子（pH、时间、装液量），以单细胞蛋白含量为评价指标进行响应面优化试验，试验因素水平见表1。

表1　响应面试验因素与水平Table 1　Factors and levels of response surface methodology

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

将单因素试验结果汇总，以SCP的产量为评价指标，筛选出最佳发酵因素及其水平，为响应面试验提供依据，试验结果见表2。

表2　单因素试验结果Table 2　Result of single factor experiment

根据表2可知，SCP产量随着初始pH的增大呈现先增大后减小的趋势，在初始pH为6时，达到最大；随着C/N的逐渐增大，SCP产量逐渐减小，且在C/N为5时SCP产量最大；SCP产量随着初始接种量的增大逐渐增大，在接种量为6%时达到最大，后逐渐减小；随着发酵时间的延长，SCP产量逐渐增大，在42 h时产量达到最高，后逐渐减小；随着发酵温度的升高，SCP产量逐渐增大，在28℃时产量达到最高，之后逐渐减小；随着装液量的增加，SCP产量逐渐增大，在140 mL/250 mL时达到最大，后开始减小。因此，得到发酵条件为初始pH 6、C/N为5、接种量6%、温度28℃、时间42 h、装液量140 mL。

2.2响应面试验结果

2.2.1响应面法试验结果及方差分析

响应面试验设计是在单因素试验的基础上进行优化的设计方案，采用极差分析对6组单因素水平进行筛选，最终选用初始pH（A）、发酵时间（B）、装液量（C）3个因素为主要考察因素，SCP产量（Y）为考察指标进行响应面试验，按响应面试验设计进行发酵生产SCP，试验设计与结果见表3，方差分析见表4。

表3　响应面试验设计与结果Table 3　Designs and results of response surface methodology

表4　响应面试验方差分析Table 4　Variance analysis of response surface methodology

应用Design Expert8.0.6软件进行多元回归拟合分析，得出发酵工艺各因素变量的二次方程模型为：Y=3.06+ 0.34A+0.18B-0.099C-0.051AB+0.29AC+0.090BC-0.50A2-0.48B2-0.37C2。

由表4方差分析可知，模型失拟项不显著（P=0.074 1＞0.05），说明方程不失拟，回归模型极显著（P=0.001 1＜0.01），模型的相关系数R2为94.65%，说明该模型能够较好的拟合实验结果，因此回归方程给黄浆水的发酵提供了一个合适的模型。从方差分析中还可以看出方程的一次项中pH对结果影响极显著（P＜0.01）、发酵温度对结果影响显著（P＜0.05），而A2、B2、C2均对结果影响极显著（P＜0.01）。这说明发酵时间、初始pH和装液量这三个因素都是在发酵过程中需要主要控制的因素。模型AB交互项影响显著，而BC、AC之间的交互作用均不显著。

2.2.2黄浆水发酵生产SCP的响应面分析

响应面图形能直观地反映各因素及其交互作用对响应值的影响，利用Design-Expert 8.0.6软件进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面图及其等高线见图1。

从各因素之间两两相互作用的响应面图形观察，各因素间有较为强的交互作用，发现其中曲线走势越陡，其影响越显著；曲线走势越平滑，其影响越小。由图1可知，三个响应因素在选定的范围内都存在极值，其中AB交互作用显著，BC、AC交互作用不显著，经过响应面得到优化的结果为初始pH6.34、发酵时间43.03 h、装液量140.36 mL/250 mL。

续表

图1　初始pH、发酵时间、装液量的交互作用对单细胞蛋白产量影响的响应面和等高线图Fig.1　Response surface plots and contour line of effects of interaction among initial pH,fermentation time and liquid volume on single cell protein production

2.3响应面验证试验

利用Design-expert 8.0.6软件进行响应面试验，通过优化得知，初始pH为6.34，发酵时间为43.03 h、装液量为140.36 mL/250 mL，经过软件分析得到的最佳SCP理论产量为3.32 g/100 mL。为了检验模型预测的准确性，考虑实际操作性，在初始pH为6，发酵时间为42 h、装液量为140 mL/250 mL条件下进行发酵验证。经过3次的重复性验证试验，测得SCP平均值为3.28 g/100 mL，与模型较吻合，说明该模型可以较好地预测发酵情况，具有实际的应用价值。

3　结论

我国豆制品种类丰富，年产量大，导致生产过程中的黄浆水产量很大，目前大采用的生化方式来处理，投资大且效果不理想。通过利用生物法发酵生产SCP以替代传统的饲料，同时降低黄浆水中的COD、BOD等污染成分。本试验利用响应面法研究黄浆水发酵SCP的工艺，以求有效的解决废水排放的问题，提高资源利用率。

本试验通过初步对初始pH、C/N、接种量、发酵温度、发酵时间、装液量等6个因素试验并进行极差分析，经过分析筛选得到3个显著因子，分别为初始pH、发酵时间、装液量。利用筛选出的因素进行响应面试验，最终得到发酵最佳工艺为：C/N为5、初始pH6、装液量140 mL/250 mL、接种量6%、发酵温度28℃、发酵时间42 h，最终经过响应面优化及验证试验得到SCP最高产量为3.28 g/100 mL。

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Optimization of fermentation process of yellow slurry water for single cell protein production by response surface method

CHE Yingjie,HAO Lin*
(College of Food Science and Engineering,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

Using yellow slurry water as raw material,Geotrichum candidum,Endomycopsis fiburiger,Candida lipolytica,andCandida utilis(2∶1∶1∶2) were selected as fermentation strains to ferment yellow slurry water.On the basis of single factor experiments,the fermentation process of yellow slurry water for single cell protein(SCP)production was studied by response surface experimental design method.The results showed that the factors affecting SCP production in order were:initial pH,fermentation time,liquid volume.The optimal extraction technology was C/N 5,initial pH 6,liquid volume 140 ml/250 ml,inoculum 6%,fermentation temperature 28℃and time 42 h.Under the optimized condition,the highest SCP production reached 3.28 g/100 ml.

yellow slurry water;single cell protein;response surface method;hydrolyzed corn starch

TQ920.9

0254-5071（2016）10-0091-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.020

2016-05-27

企业横向联合项目

车颖洁（1992-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。

郝林（1957-），男，教授，博士，研究方向为食品微生物学。