商业酵母对马瑟兰干红葡萄酒香气成分的影响

苗丽平，赵新节*，董书甲，姜凯凯，2，原苗苗

（1.齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南250353；2.山东省农业科学院农产品研究所，山东济南250100）

商业酵母对马瑟兰干红葡萄酒香气成分的影响

苗丽平1，赵新节1*，董书甲1，姜凯凯1，2，原苗苗1

（1.齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南250353；2.山东省农业科学院农产品研究所，山东济南250100）

以酿酒葡萄品种马瑟兰为原料，分别用4种商业酵母单一或混合酿制马瑟兰干红葡萄酒，采用顶空固相微萃取（HS-SPME）和气质联用（GC-MS）技术对其香气成分进行分析，探究山东蓬莱产区马瑟兰干红葡萄酒的香气组成，同时为生产实践选择合适的酵母。不同酵母酿制的马瑟兰干红葡萄酒共检测到79种挥发性物质，通过对其香气成分进行分类比较分析表明，酵母71B所酿制的酒具有较高的C6醇、乙酸酯；酵母BDX所酿的酒具有较低的己醇、辛酸、己酸，较高的脂肪酸乙酯、苯乙醇、3-乙氧基丙醇；酵母K1和D254酿制的酒中乙酸酯和脂肪酸乙酯的含量都非常接近。混合酵母酿制的酒中高级醇、乙酸酯和脂肪酸含量普遍比单一酵母酿制的酒高。

马瑟兰；气相色谱-质谱法；香气成分；酵母

葡萄酒的香气成分决定着葡萄酒的风味特征和典型性[1]。葡萄酒中的芳香性物质主要有醇类、酯类、有机酸、萜烯类、醛和酮、酚类等[2]。这些物质的含量、种类以及它们之间的相互作用对葡萄酒的风格和质量有着重要作用。按照香气来源，葡萄酒的香气可分为品种香、发酵香和陈酿香。品种香是直接来源于葡萄果实中的香气，陈酿香主要是在陈酿过程中由于各种氧化还原反应、酯化反应等产生的香气[3-4]。发酵香是在葡萄酒发酵过程中产生的香气，与酵母菌的种类或菌株有很大关系。不同酵母菌株在酒精发酵过程中的代谢反应不同，所产生代谢产物的种类及其量也不同，不仅对葡萄酒香气产生直接影响，还能对品种香气进行修饰，也能影响到未来的陈酿香气[2，5]。对葡萄酒的香气特征与风格具有重要作用。

马瑟兰（Marselan）是由法国农业科学研究院（national institute for agricultural research，INRA）1961年用赤霞珠和歌海娜杂交培育的红色酿酒葡萄，兼具歌海娜的耐热性和赤霞珠的细腻感，2001年引入我国，目前在我国山东蓬莱，河北昌黎、沙城，北京房山、延庆，甘肃威武，新疆焉耆、伊犁等地都有种植[6]。马瑟兰在我国葡萄酒产区的适应性与酿酒潜质逐步显现，越来越受到中国酒庄和消费者的重视。赵德升等[7]分析了河北怀来2006和2007年份马瑟兰葡萄果实的香气物质组成及含量，并与赤霞珠果实作了对比。国内外关于商业酵母和野生酵母对葡萄酒香气成分的研究报道较多，其结果大多显示不同酵母对香气的种类影响不大，对香气含量的影响较为显著[8]。使用不同的酵母发酵生产葡萄酒，可以赋予其更加丰富多样的风格。但是关于酵母对葡萄酒香气成分影响的研究多使用赤霞珠、美乐、西拉等葡萄品种酿制的葡萄酒为材料，关于马瑟兰葡萄酒的香气的研究比较少，尤其是对山东蓬莱地区马瑟兰葡萄酒香气成分的研究还少见报道。

本实验选取4种商业酿酒酵母（71B、BDX、K1、D254），根据产品介绍这4种酵母各具特点：酵母71B，由法国农业科学研究院（INRA）筛选得到，该酵母非常适合用于酿造平和润美、新鲜果香的红葡萄酒，尤其可以赋予葡萄酒热带水果的特征；酵母BDX筛选自波尔多，具有完美的发酵动力学表现，平稳有力，产挥发酸和泡沫少，推荐用于极高品质的红葡萄酒酿造，所酿酒品具有特色的风味、品种香气及其复杂性；酵母K1由法国农业科学研究院1972年分离筛选得到，该酵母首先倾向于突出葡萄品种的新鲜淡雅爽洁特性，可更长时间的保持新鲜水果的香气；酵母D254在红葡萄酒酿造中，不仅可以表现出李子、黑莓和葡萄干的香气，而且还会产生雪松、杜松、胡椒和甘草等风味，所酿酒香气丰富浓郁。

本实验将上述4种酵母单独或混合发酵酿制马瑟兰干红葡萄酒，采用顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）和气质联用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）技术对酒样中香气成分进行分析，探究山东蓬莱产区马瑟兰干红葡萄酒的香气组成，同时为选择合适的酿酒酵母生产优质的马瑟兰干红葡萄酒提供理论参考依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1酿酒葡萄

马瑟兰葡萄：2015年从山东蓬莱中粮长城葡萄酒（烟台）有限公司葡萄园采摘（经度：120°54′30.924"，纬度：37°48′27.684"，海拔46 m）；马瑟兰葡萄的基础数据为含糖量（以葡萄糖计）185.4g/L，含酸量（以酒石酸计）为5.12g/L，pH值为3.62。

1.1.2酿酒酵母

酵母71B、BDX、K1、D254：上海杰兔工贸有限公司。

1.1.3试剂

乙酸乙酯、丁酸乙酯、1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、乙酸异戊酯、1-丁醇、己酸甲酯、己酸乙酯、苯乙烯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、1-己醇、2-壬酮、辛酸乙酯、乙酸、庚醇、里那醇、1-辛醇、癸酸甲酯、癸酸乙酯、3-甲硫基-1-丙醇、己酸、月桂酸乙酯、苯甲醇、辛酸、癸酸：美国Sigma公司；4-甲基-2-戊醇（纯度98%）：美国Aldrich公司；NaCl（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；果胶酶EX-V（多聚半乳糖醛酸酶80%，果胶酯酶18%，果胶裂解酶2%）：上海杰兔工贸有限公司。

1.2仪器与设备

自动固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、7890B气相色谱-5977A型质谱联用仪：美国Supelco公司；DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国J&W公司。

1.3方法

1.3.1葡萄酒的加工工艺流程及操作要点

马瑟兰葡萄→穗选与粒选→除梗破碎→葡萄汁（EX-V果胶酶50 mg/L）→SO2处理（60 mg/L）→24 h后接酵母（100 mg/L）→25℃发酵→发酵结束→皮渣分离，调硫→冷稳定澄清→马瑟兰干红葡萄酒

操作要点：

（1）酵母活化：将活性干酵母按1∶10（g∶mL）的比例投放于37℃左右的含糖量为5%的温糖水中，搅拌活化30 min。

（2）酵母添加量：单一酵母按照100 mg/L的量进行添加，混合酵母是酵母71B、BDX、K1、D254四种酵母的等量混合并且其总量为100 mg/L。

1.3.2葡萄酒基本指标的测定

葡萄酒基本成分理化指标检测严格按照国家标准GB/T I5038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法进行检测。主要包括酒精度、pH值、总糖、总酸、挥发酸、残糖、总酚、单宁等指标。

1.3.3香气物质提取

精确量取8 mL酒样放入20 mL的顶空瓶中，加入2 g NaCl促进香气成分的挥发，再加入20μL的质量浓度为2g/L的内标（4-甲基-2-戊醇），立刻用聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）/硅橡胶隔垫密封压紧。当温度到达45℃时，用DVB/CAR/PDMS的萃取头萃取50min，解吸10min，进样气相色谱-质谱分析。

1.3.4GC-MS条件

气相色谱条件：DB-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm），汽化室温度250℃，载气为氦气（He），流速1.221 1mL/min，不分流进样。采用梯度升温程序：初始值为40℃，保持2 min；以1℃/min升温至45℃，保持2 min；以3℃/min升温至84℃，保持2 min；以3℃/min升温至120℃，保持3 min；以3℃/min升温至200℃；以5℃/min升温至230℃。

质谱条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，进样器温度250℃，检测器温度250℃，电子能量70 eV；离子源温度230℃，全扫描模式，质量扫描范围：30～400m/z，无溶剂延迟。

1.3.5香气成分的定性和定量分析

定性分析：用气相色谱质谱计算机联用仪进行分析鉴定。分析结果运用计算机谱库美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14.L进行初步检索及资料分析，再根据标品的保留时间结合文献进行人工谱图解析，确认香气物质的各个化学成分。

定量分析：采用内标法进行定量。

2　结果与分析

2.1不同酵母酿制酒样的理化指标

对不同酵母酿制的马瑟兰葡萄酒的理化指标进行测定，结果见表1。从表1可以看出，残糖量均＜4 g/L，符合干酒的标准，酒精度均＞10%vol，混合酵母酿造的干红葡萄酒的酒精度、总酚、单宁的含量都高于单一酵母处理的结果。在不同酵母处理的结果中，酵母BDX处理的总酚、单宁都是最低的，总酚比混合酵母处理的结果低了0.34 g/L，单宁低了250.6 mg/L。其他剩余三种酵母对总酚的浸提效果相近，酵母71B、K1酿造的干红葡萄酒中单宁含量分别为555.7 mg/L和546.7 mg/L，差值仅为9.0 mg/L。酵母D254酿造的干红葡萄酒中单宁含量相对较高为614.45 mg/L。总酚和单宁含量的差异可能和不同酵母的产酒精性能的高低有关，混合酵母发酵的酒样中酒精度最高，相应的总酚和单宁含量也是最高的。酵母BDX和K1的酒精度较低，相应的总酚和单宁含量也比较低。较高的酒精度有利于酚类和单宁的浸提[9]。不同酵母发酵的葡萄酒中总酸含量在5.4～6.6 g/L，没有明显差别，且都在合理范围内；挥发酸在0.2～0.4 g/L，符合国家标准。从表1中的酒样的基本指标可以看出，本实验中不同酵母发酵的马瑟兰葡萄酒各项指标符合国家标准，这四种商业酵母符合生产实践的基本要求。

表1　不同酵母发酵的干红葡萄酒的理化指标Table 1　Physicochemical indexes of dry red wine brewed by different yeasts

2.2马瑟兰干红葡萄酒香气成分检测

图1　酵母71B(A)、BDX(B)、K1(C)、D254(D)及混合酵母(E)酿造马瑟兰干红葡萄酒香气成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.1　Total ion chromatogram of aroma components in Marselan dry red wine brewed by yeast 71B(A),BDX(B),K1(C),D254(D)and mixed yeasts(E)analysis by GC-MS

以不同酵母酿造的马瑟兰干红葡萄酒，经固相微萃取及气质联用仪分析，其香气成分的GC-MS总离子流色谱图见图1，分析鉴定结果见表2。

表2　不同酵母酿造马瑟兰干红葡萄酒中香气成分的GC-MS分析结果Table 2　GC-MS analysis results of aroma components in Marselan dry red wine brewed by different yeastsmg/L

续表

由图1及表2可知，不同酵母酿造马瑟兰干红葡萄酒中共检测到挥发性香气物质79种，包括醇类29种，酯类27种，酸类6种，萜烯类9种（包括7种单萜和2种C13降异戊二烯），酮类3种，羰基化合物2种，苯类物质2种，酚类1种。

2.3马瑟兰干红葡萄酒香气成分分析

将不同酵母发酵的马瑟兰干红葡萄酒检测到的香气成分进行类别及相对含量分析，结果见表3。由表3可知，不同酵母发酵的马瑟兰干红葡萄酒检测到的香气成分醇类＞酸类＞酯类＞酮类＞萜烯类＞酚类＞羰基化合物＞苯类，分别占到总香气的55.368%、36.055%、8.360%、0.181%、0. 019%、0.013%、羰基化合物类和苯类共占约0.004%，醇类占到了一半以上，醇类、酯类和酸类是马瑟兰干红葡萄酒的主要挥发性物质，占到了99.783%。

表3　马瑟兰干红葡萄酒中各类香气成分相对含量Table 3　Relative contents of volatile compounds of Marselan dry red wine

2.3.1不同酵母对马瑟兰葡萄酒醇类成分的影响

C6醇类物质具有植物味和青草气息，通常给葡萄酒香气带来生青味[10]。其中己醇的含量最高，占到C6醇的90%以上，并超过其阈值（1 100 μg/L[10]），这可能和葡萄的成熟度有关，己醇在5种酵母发酵的马瑟兰葡萄酒中都存在，并且混合酵母发酵的含量最高，BDX酵母发酵的葡萄酒中己醇含量相对较少。K1和D254发酵的酒中己醇含量非常接近，分别为10.27 mg/L和10.02 mg/L。

丙醇（酒精味，成熟果香）、异丁醇（溶剂味，酒精味，生青味）、异戊醇（溶剂味，酒精味，指甲油味道）、苯乙醇（玫瑰花，蜂蜜味）是酵母合成的主要高级醇[11]，异丁醇的阈值是75 000 μg/L[10]，本实验的酒中异丁醇平均超过阈值2倍多，异戊醇超过阈值20倍多（阈值60 000 μg/L[10]），另外2,3-丁二醇的含量也比较高，且不同酵母酿制的酒中其含量相差较大，2,3-丁二醇是在发酵后期由双乙酰还原生成[12]，说明这几种酵母对双乙酰的还原能力相差较大。

不同酵母产丙醇的能力相差比较大，K1＞混合酵母＞BDX＞71B＞D254，酵母K1的产丙醇能力最强（129.71 mg/L），酵母D254产丙醇的含量为70.85 mg/L，相差58.86 mg/L。酵母K1和混合酵母发酵的酒样丙醇含量均＞120 mg/L，酵母71B和BDX的丙醇含量相近，都在90 mg/L左右。丙醇具有酒精味和成熟的果香，有较高的阈值306 000 μg/L[10]，五种酵母处理的马瑟兰葡萄酒中丙醇的含量都没有达到其阈值。

不同酵母产异丁醇的能力也有所差别，酵母71B、BDX、K1、D254、混合酵母的异丁醇含量分别为140.73 mg/L、 146.75 mg/L、155.99 mg/L、163.42 mg/L、177.23 mg/L，可以看出混合酵母的异丁醇的含量最高，酵母D254次之。异丁醇往往给葡萄酒带来溶剂味、酒精味和生青味，阈值为75 000 μg/L[10]，五种酵母发酵的马瑟兰葡萄酒的异丁醇含量都超过其阈值，可能一方面和酵母有关，另一方面和原料的成熟度有关。

异戊醇是高级醇中含量最高的醇类占到高级醇的70%以上，达到了1 g/L以上，超过其阈值，给葡萄酒带来溶剂味、酒精味和指甲油味道，其中混合酵母发酵的酒中异戊醇的含量最高，达到了1.62g/L，比含量最低的K1高出0.58g/L。单一发酵的酵母中，酵母BDX的异戊醇含量最高（1.38 g/L），酵母71B次之，酵母K1最低。

苯乙醇和3-乙氧基丙醇带来花香和果香的物质含量分别超过阈值5倍多和100倍，3-乙氧基丙醇超过阈值100倍，给马瑟兰干红葡萄酒带来浓郁的果香。71B、BDX产3-乙氧基丙醇的量比较高，在12 mg/L以上，D254的含量最低为8.997 7 mg/L，但也超过其阈值。总体来看3-乙氧基丙醇的含量都比较高，这可能和葡萄原料有关。

苯乙醇阈值较低。本实验的酒样中的苯乙醇含量都比较高，超过阈值5倍多。其中酵母BDX的苯乙醇含量最高（94.89 mg/L），K1次之，为87.70 mg/L，酵母D254和71B的苯乙醇含量都是略微高于70 mg/L。

酵母在发酵初期生成较多的双乙酰，在发酵后期双乙酰被还原成2,3-丁二醇，阈值比较高，无气味，略带甜味，一般不影响酒质量[12]。不同酵母酿制的酒中2,3-丁二醇的含量相差较大，酵母K1最高（80.2 mg/L），D254最低仅为21.93 mg/L。

不同酵母酿制的马瑟兰葡萄酒中，酵母71B、BDX的3-乙氧基丙醇的含量比较高，酵母BDX的苯乙醇含量最高，酵母K1的丙醇含量最高，酵母71B和D254的丙醇含量和苯乙醇含量都比较低，且含量非常相近。从高级醇的总量来看，酵母K1最低，混合酵母最高。

2.3.2不同酵母对马瑟兰葡萄酒酯类物质成分的影响

大多数的酯类物质都是酵母次生代谢产物，还有一些是在陈酿过程中通过有机酸和高级醇的酯化反应形成的[13]。乙酸酯是由氨基酸或糖降解产生的高级醇与乙酰辅酶A（acetyl-coenzyme A，acetyl-CoA）形成的[14]。本实验不同酵母酿制的酒中都检测到5种乙酸酯，其中乙酸乙酯的含量最高，且超过其阈值，带来令人愉悦的香甜的水果味[15]。71B酵母和混合酵母产乙酸乙酯的含量比较高，酵母BDX的含量比较低，但是也高于其阈值。因为混合酵母是由前四种酵母等量混合的，由此推测酵母71B产乙酸乙酯的能力比较强，BDX相对较弱。乙酸乙酯含量＞150 mg/L时会有醋酸味[16]，这五种酵母中只有酵母BDX和D254中乙酸乙酯含量＜150 mg/L。其他几种乙酸酯不同酵母之间也没有太大的差别，虽然没有超过阈值，但是他们与其他香气之间相互作用对马瑟兰干红葡萄酒的花香和果香贡献比较大。

本实验中检测出13种脂肪酸乙酯，包括丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乳酸乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯等。其中己酸乙酯（香蕉、青苹果）、辛酸乙酯（香蕉、梨、花香）、棕榈酸乙酯（青苹果、菠萝味）超过其阈值，给葡萄酒带来令人愉悦的花香和果香。从不同的酵母来看，混合酵母产己酸乙酯的能力大于单一酵母，在单一酵母中，酵母D254的产己酸乙酯的能力最强（10.61 mg/L）。酵母K1最弱，为3.31 mg/L。乳酸乙酯的阈值比较高，具有果香和奶油香，几种酵母产乳酸的含量都没有超过其阈值，但是BDX的产乳酸能力远远高于其他酵母，高达107.67 mg/L，其他几种酵母的产乳酸含量在52～74 mg/L，没有明显差别。辛酸乙酯和癸酸乙酯也超过其阈值，不同酵母产辛酸乙酯的能力相近，含量差别不大，混合酵母和D254产癸酸乙酯的能力高于其他酵母，是其他三种酵母的20倍左右，且酵母D254比混合酵母的癸酸乙酯含量略高。

其他酯类的含量都比较低，不同酵母之间也没有什么差别，其中辛酸甲酯超过其阈值，给葡萄酒带来柑橘的香气。

2.3.3酵母对马瑟兰葡萄酒其他挥发性物质的影响

挥发性脂肪酸在其浓度低于阈值的时候会增加葡萄酒香气的复杂性，但当其浓度超过其阈值时就会对酒的香气造成负面影响[17]。本实验检测出6种脂肪酸，其中己酸和辛酸超过其阈值，会给葡萄酒带来负面影响，不同酵母酿制的酒中，己酸、辛酸以及脂肪酸的总量来看，趋势都是混合酵母＞D254＞71B＞K1＞BDX。且酵母BDX的己酸和辛酸含量都分别非常相近，分别相差0.08 mg/L和0.04 mg/L。

萜烯类来源于果实本身的香气，本实验共检测出9种萜烯类物质。包括7种单萜类物质：β-月桂烯、D-柠檬烯、里那醇、香茅醇、α-萜品油烯、橙花醇、香叶醇，两种C13降异戊二烯：β-紫罗兰酮和β-大马士酮。这两类物质主要为葡萄酒提供花香类香气。在单萜类物质中酵母BDX和混合酵母发酵的酒中香叶醇的含量超过了其阈值，给葡萄酒带来柠檬味和天竺葵味，71B发酵的酒中香叶醇的含量低于其阈值，酵母K1和D254中没有检测到，可能是含量过低，也可能是以糖苷键的形式存在，没有挥发性，而酵母BDX和混合酵母以及酵母71B中的酶裂解糖苷键，使萜烯游离，由含量推测酵母BDX和混合酵母中的这种酶的活性和含量比较高。

3　结论

不同酵母发酵的马瑟兰葡萄酒中，混合酵母的醇类、酸类、酯类的含量都比较高，选择混合酵母有利于生产香气复杂浓郁的葡萄酒；酵母71B的异丁醇、异戊醇的含量最低的，乙酸乙酯以及乙酸酯的总量远高于其他单一酵母。可以用于生产果香型葡萄酒；酵母BDX的C6醇、酸类的含量比较低，乳酸乙酯的含量远高于其他酵母，是其含量的1.5～2.0倍。适合用来生产口感柔和，奶香味丰富的葡萄酒；和其他酵母相比，酵母K1和D254发酵的马瑟兰葡萄酒主要的香气成分包括醇类、酯类、酸类的含量都处于中低水平，可以用于中性葡萄酒的生产。

混合酵母发酵一方面产生比较高的C6醇和高级醇，相对较高的己酸和辛酸，过高的乙酸乙酯给马瑟兰干红葡萄酒带来负面影响。另一方面相对其他单一酵母具有比较高的己酸乙酯和癸酸乙酯给葡萄酒带来令人愉悦的花香和果香。如何更好的发挥混合酵母的优势，降低其劣势，需要对针对特定葡萄品种对混合酵母的种类以及它们之间的配比进行进一步的实验研究。

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Effects of commercial yeasts starter on aroma components of Marselan dry red wine

MIAO Liping1,ZHAO Xinjie1*,Dong Shujia1,JIANG Kaikai1,2,YUAN Miaomiao1
(1.School of Bioengineering,Qilu University of Technology,Ji'nan 250353,China; 2.Institute of Agro-Food Science and Technology,Shandong Academy of Agricultural Science,Ji'nan 250100,China)

Using Marselan wine grape as raw material,Marselan dry red wine was brewed by single or mixed four kinds of commercial yeasts starters, respectively,and its aroma components were analyzed by HS-SPME and GC-MS.The aroma components of Marselan dry red wine from Shandong Penglai regions were investigated,and the appropriate yeasts starter for the production practice were selected.Results indicated that 79 kinds of aroma compounds were detected from Marselan dry red wine.By classification and comparison of the aroma components,the analysis results showed that the content of C6 alcohols and acetate esters in the wine brewed by Yeast 71B were higher.The content of hexanol,octanoic acid,hexanoic acid in the wine brewed by Yeast BDX were lower,and the content of fatty acid ethyl esters,phenylethyl alcohol,3-ethoxy-1-propanol in the wine were higher.The content of acetate esters and fatty acid ethyl esters in the wine brewed by Yeast K1 were similar with that in the wine brewed by Yeast D254.The content of higher alcohols,acetate esters and fatty acids in the wine brewed by mixed yeasts starter were generally higher than that in the wine brewed by single yeast starter.

Marselan;GC-MS;aroma components;yeast

TS261.1；TS262.6；O657.63

0254-5071（2016）10-0056-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.013

2016-07-10

山东省现代农业产业技术体系果品产业创新团队项目（SDAIT-06-14）

苗丽平（1990-），女，硕士研究生，研究方向为葡萄与葡萄酒。

赵新节（1962-），男，教授，博士，研究方向为葡萄与葡萄酒。