四溴双酚A对太平洋真宽水蚤的急性毒性及氧化胁迫

巩文静，朱丽岩，郝雅，江田田，韩萃

1. 中国海洋大学 海洋生命学院，青岛 266003 2. 济宁医学院 法医与医学检验学院，济宁 272067



四溴双酚A对太平洋真宽水蚤的急性毒性及氧化胁迫

巩文静1,2，朱丽岩1,*，郝雅1，江田田1，韩萃1

1. 中国海洋大学 海洋生命学院，青岛 266003 2. 济宁医学院 法医与医学检验学院，济宁 272067

为了研究四溴双酚A(tetrabromobis-phenol A，TBBPA)对海洋桡足类的急性毒性和氧化胁迫效应，以太平洋真宽水蚤为受试生物，测定了TBBPA对其96 h急性毒性和对其体内抗氧化防御系统的影响。结果表明，TBBPA对太平洋真宽水蚤的96 h半数致死浓度(96 h-LC50)为178 μg·L-1，95%可信区间为91～306 μg·L-1，表现为极毒。亚致死浓度下，TBBPA能够不同程度影响太平洋真宽水蚤的抗氧化防御酶活力以及非酶物质含量。其中SOD和GST活性的变化趋势较为一致，暴露初期SOD和GST活性显著上升(P<0.05)，随暴露时间延长酶活性有所下降，最终趋向对照组水平；GPx活性水平始终维持在对照组以上并且差异显著(P<0.05)；暴露初期，GSH含量受轻微氧化压力而轻微升高，暴露48 h后GSH含量急剧下降并显著低于对照组(P<0.05)。太平洋真宽水蚤体内SOD、GST、GPx活性和GSH含量对TBBPA暴露均十分敏感，能够为海洋环境的TBBPA监测提供生化指标参考。

四溴双酚A；太平洋真宽水蚤；急性毒性；抗氧化防御系统

四溴双酚A (tetrabromobis-phenol A, TBBPA)是目前全球产量最大的溴系阻燃剂(brominated flame retardant, BFRs)之一[1]。作为反应型阻燃剂，TBBPA广泛应用于各类树脂当中，并能够作为添加型阻燃剂在一些高分子聚合物中发挥作用[2-3]。随着TBBPA在生活生产过程中的广泛使用，其在各类环境介质和生物体中的含量不断累积[4]，因此近年来国内外关于TBBPA生态毒理效应的研究也相继开展[5]。由于TBBPA的分子结构与甲状腺素(thyroxin, T4)相似，因此可被定义为潜在的内分泌干扰物，具有甲状腺干扰性、免疫和细胞毒性、神经毒性以及雌激素干扰性等诸多器官、细胞和生化水平上的毒性效应[3-4]。现有研究表明，TBBPA很可能是一种新的“多氯联苯(PCBs)问题”[6]。

抗氧化防御系统是机体对外源环境污染胁迫做出快速响应的一类物质的总称，在防御机体免受抗氧化应激损伤的过程中发挥重要的作用[7-8]。研究表明，生物体活性氧的产生及其引起的氧化损伤是污染物致毒的重要路径[8]。由于对轻微污染物胁迫即表现出敏感变化，以抗氧化酶和其他非酶物质(谷胱甘肽和维生素C、E等)活性或含量变化作为毒理学指标可以为环境污染提供早期预警[9-10]。

桡足类作为海洋环境中浮游动物的最大组成部分，在基础营养传递链中发挥至关重要的作用，因此，以桡足类作为模式生物进行毒理学研究具有重要的生态学意义[11]。太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)隶属于哲水蚤目(Calanoida)、宽水蚤科(Temoridae)、真宽水蚤属(Eurytemora)，是低盐区十分常见的暖水性沿岸桡足类物种之一[12]。具有易于采集、个体较大、性别特征明显、便于观察等优点，可作为生态毒理学各项指标测定研究的较为理想的受试生物。目前关于太平洋真宽水蚤的研究主要集中在生态动力学自然生态调查方面，而关于有机物污染对太平洋真宽水蚤的毒性毒理作用研究报道还相对较少。因此，本文以太平洋真宽水蚤作为受试生物，测定了TBBPA对目标桡足类96 h-LC50，并研究了不同浓度TBBPA暴露对太平洋真宽水蚤超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性和谷胱甘肽(GSH)含量的影响。研究旨在从生化水平上初步揭示TBBPA的毒性作用机制，以及污染物可能对桡足类造成的分子水平上的损伤。研究还能为评价桡足类对TBBPA的解毒能力和机制以及TBBPA的毒性效应提供参考。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 实验材料

1.1.1 受试生物采集与培养

太平洋真宽水蚤采自青岛市崂山区南窑虾池。室内培养条件为温度(18±1) ℃，盐度30，光周期12 h L:12 h D。驯化2周后，挑取健康活泼的桡足类成体用作实验对象。

选取球等鞭金藻、三角褐指藻和小球藻作为混合饵料进行投喂，投喂体积比例为5:3:2。藻种日常培养于经0.45 μm和0.22 μm滤膜2次过滤后的自然海水中，海水经高压灭菌1 h，冷却后加入f/2营养液。藻种培养条件为温度(20±1) ℃，盐度25，光周期12 h L:12 h D。

1.1.2 化学品制备

实验使用的TBBPA固体和二甲基亚砜(DMSO)均为分析纯，分别购自J&K化学试剂有限公司和国药集团化学试剂有限公司，TBBPA纯度>98%。实验原液参照已有文献中的标准设计。使用DMSO作为助溶剂，配制浓度为5 g·L-1的母液A。之后使用过滤海水将母液A稀释至合适浓度(100 mg·L-1，母液B)。根据文献要求，为保证助溶剂对实验无影响，DMSO所占比例不超过实验溶液总体积的0.2%[12]。

1.2 实验方法

1.2.1 急性毒性实验

实验设定TBBPA暴露浓度梯度为50、125、312.5、780、1 953 μg·L-1共5个浓度组(公比=2.5)和2个对照组(空白和DMSO)，每组设置3个平行，每个平行投入15只水蚤。实验周期96 h，以球等鞭金藻作为单一饵料，每隔24 h观察记录桡足类的存活情况。

1.2.2 TBBPA对抗氧化防御系统的影响

实验设置5个浓度组和1个溶剂对照组，各浓度组TBBPA浓度梯度分别为96 h-LC50的0、1.25%、2.5%、5%、10%和20%，每组设置3个平行，每个平行放入约200只太平洋真宽水蚤。以球等鞭金藻作为单一饵料。实验开始后，分别于0、12、24、36、48、72、96 h时从各平行中随机取出75只太平洋真宽水蚤平分放入3个Eppendorf管中。吸干虫体表面水分后向Eppendorf管中各加入430 μL生理盐水，超声波破碎5 min后室温8 000 r·min-1离心10 min，上清液即为酶液。

总蛋白含量测定：取24支Eppendorf管，依次分别加入0、3、6、12、18、24、30、36 μL的0.5 mg·mL-1牛血清蛋白溶液，每组3个平行，用超纯水补足体积至100 μL。实验时以牛血清蛋白为标志物，参照考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[13]。

SOD活性测定采用改良的邻苯三酚自氧化法[14]。GST活性测定参照Habig等[15]开发的方法。GPx活性测定方法参照DTNB比色法[16]。GSH含量测定参考范崇东等[17]的测定方法并稍作改进。

1.3 数据处理

使用软件Microsoft Excel对数据进行初步统计处理。使用SPSS 16.0计算求得TBBPA对目标桡足类的96 h-LC50和95%置信区间。各组间的差异使用one-way ANOVA进行单因素方差分析，并通过LSD法对对照组和浓度组组间数据进行差异性显著分析。各组间的差异使用字母a～d表示，同一处理组(相同颜色柱形条)中字母标示不同者表示差异显著(P<0.05)。

2 结果(Results)

2.1 TBBPA对太平洋真宽水蚤的急性毒性

急性毒性实验中，空白和溶剂对照组太平洋真宽水蚤未出现死亡个体。处理组中随着TBBPA浓度增高，死亡率逐渐升高，最高浓度组1 953 μg·L-1死亡率达95%以上(图1)。最低浓度组个体的死亡率较低，当浓度升至125 μg·L-1时死亡率骤增，并且此时尚存活的个体活性明显降低。求得TBBPA暴露下太平洋真宽水蚤的96 h-LC50为178 μg·L-1，其95%可信区间为91～306 μg·L-1，回归曲线为y=20.217x-19.538，R2=0.94021。

2.2 TBBPA对太平洋真宽水蚤抗氧化防御系统的影响

2.2.1 SOD活性变化

实验过程中，空白和溶剂对照组实验结果较为一致，各取样时间测定结果均无显著差异，因此将溶剂对照组结果作为评价各处理组指标变化的参照。96 h TBBPA暴露过程中，各浓度组SOD活性整体呈现先升高后趋于平稳的变化趋势(图2)。0～12 h的暴露过程中，各组SOD活性均受到TBBPA的持续诱导激活(P<0.05)。随着暴露时间延长，12～48 h各浓度组SOD活性均出现不同程度的降低(P<0.05)。至暴露48 h后，各浓度组太平洋真宽水蚤SOD活性变化趋于平缓，各组与对照组之间普遍无显著差异(P>0.05)。分析结果得出，12 h时SOD活性随TBBPA浓度的升高不断降低，呈现较为明显的剂量-效应关系；4.5 μg·L-1浓度组SOD活性随暴露时间延长不断降低，呈现较为明显的时间-效应关系。

图1 不同浓度TBBPA暴露96 h后太平洋真宽水蚤的平均死亡率(误差线表示标准差，n=3)Fig. 1 Average mortalities of Eurytemora pacifica exposed to various concentrations of TBBPA for 96 h (Data is mean ± SE, n=3)

图2 不同浓度TBBPA暴露下太平洋真宽水蚤的SOD活性注：误差线表示标准差，n=3。使用a、b、c、d表示不同暴露时间下的组间差异性，P<0.05。Fig. 2 The SOD activity of E. pacifica exposed to different concentrations of TBBPA during the experimental periodNote: Data is mean ± SE (n=3). The same pattern bars with different letters indicate a significant difference between treatments and controls， P<0.05.

2.2.2 GST活性变化

TBBPA持续96 h的暴露过程中，GST活性整体呈现先上升后下降的变化趋势(图3)。与对照组相比，暴露0～36 h期间各处理组桡足类GST活性均普遍受到了诱导激活(P<0.05)。随着暴露时间的延长，对照组和各处理组中太平洋真宽水蚤GST活性均不同程度地下降。至暴露96 h后，除最低浓度组外，TBBPA对各组桡足类GST活性影响均不显著(P>0.05)。

图3 不同浓度TBBPA暴露下太平洋真宽水蚤的GST活性注：误差线表示标准差，n=3。使用a、b、c、d表示不同暴露时间下的组间差异性，P<0.05。Fig. 3 The GST activity of E. pacifica exposed to different concentrations of TBBPA during the experimental periodNote: Data is mean ± SE (n=3). The same pattern bars with different letters indicate a significant difference between treatments and controls, P<0.05.

图4 不同浓度TBBPA暴露下太平洋真宽水蚤GPx的活性注：误差线表示标准差，n=3。使用a、b、c、d表示不同暴露时间下的组间差异性，P<0.05。Fig. 4 The GPx activity of E. pacifica exposed to different concentrations of TBBPA during the experimental periodNote: Data is mean ± SE (n=3). The same pattern bars with different letters indicate a significant difference between treatments and controls, P<0.05.

2.2.3 GPx活性变化

在持续96 h的实验过程中，对照组桡足类GPx活性的变化幅度不大(图4)。与对照组相比，各浓度梯度TBBPA暴露下的太平洋真宽水蚤GPx活性均表现出显著的诱导表达趋势，12～96 h各处理组的GPx活性始终高于对照组(P<0.05)。

2.2.4 GSH含量变化

对照组GSH含量随时间变化不大，各TBBPA处理组GSH含量整体呈现先轻微上升后下降的变化趋势(图5)。0～48 h期间，各浓度组GSH含量均普遍受到TBBPA暴露的轻微诱导表达(P>0.05)。48～96 h期间，TBBPA处理组GSH含量逐渐减少。至暴露96 h时，各浓度组GSH含量均显著低于对照组(P<0.05)。

图5 不同浓度TBBPA暴露下太平洋真宽水蚤的GSH含量注：误差线表示标准差，n=3。使用a、b、c、d表示不同暴露时间下的组间差异性，P<0.05。Fig. 5 The GSH content of E. pacifica exposed to different concentrations of TBBPA during the experimental periodNote: Data is mean ± SE (n=3). The same pattern bars with different letters indicate a significant difference between treatments and controls, P<0.05.

3 讨论(Discussion)

3.1 急性毒性影响

实验条件下，TBBPA对太平洋真宽水蚤的96 h-LC50为178 μg·L-1。根据《新化学物质危害评估导则(HJ/T154-2004)》的毒性评定标准(极高毒性：≤1 mg·L-1，高毒性：1～10 mg·L-1，中毒性：10～100 mg·L-1，低毒性：≥100 mg·L-1)[18]，TBBPA太平洋真宽水蚤毒性极高。先前研究结果显示，TBBPA对中华哲水蚤的96 h-LC50为427.6 μg·L-1[19]，对大型溞和糠虾的LC50约为1 mg·L-1[20]。这表明TBBPA对水生无脊椎动物的急性毒性普遍在高毒性甚至极高毒性水平上[21]。

3.2 抗氧化防御系统影响

先前研究表明，许多有机污染物及其降解产物会引起生物体产生氧化应激反应。在有机污染物进入生物体后发生的代谢过程中，往往会产生大量的具有强氧化能力的中间产物，如活性氧中间体(ROS)、氧自由基等。正常生理状态下，生物体产生和清除自由基的速率处于动态平衡状态，而当外源性有害物质的干扰打破这种平衡后，活性氧便会持续累积产生，生物体内自由基增加，继而会对生物体的蛋白质、脂质和DNA等生物大分子造成损伤，最终导致细胞的死亡[8]。抗氧化防御系统作为活性氧的去除系统，在参与活性氧的清除以及机体的保护性防御反应中发挥巨大作用。其对外源污染物胁迫相当敏感，可为污染物胁迫下的机体氧化应激提供敏感信息。因此，对于新型有机污染物，研究其对生物体的氧化胁迫作用不仅能够客观分析污染物的毒性水平和效应，同时也有助于掌握其毒性机制。

超氧化物歧化酶(SOD)作为抗氧化防御系统的第一道防线，是体内唯一以氧自由基为底物的抗氧化酶，同时也是生物防卫机制的中心酶[8,22]。徐楠等[23]的研究表明，在氧化胁迫程度较低时，SOD酶活性被诱导并与活性氧自由基作用，但当细胞内活性氧数量超过正常的歧化能力后，细胞内多种功能受到破坏，SOD活性逐渐受到抑制。谷胱甘肽硫转移酶(GST)作为谷胱甘肽结合反应的关键酶，能够催化谷胱甘肽结合反应的起始步骤，使亲核性的谷胱甘肽(GSH)与各种亲电子外源化学物相结合，继而起到解毒作用[8]。李亚宁等[24]和薛银刚等[25]分别研究了不同浓度TBBPA暴露对颤蚓(Monopylephorus limosus)和赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)的抗氧化防御系统的影响，结果显示实验范围内低浓度TBBPA暴露均能显著诱导GST活性上升。上述结论与本研究得到的结果基本一致。本研究中，SOD和GST活性随TBBPA暴露的变化趋势较为一致，二者的活性变化共同反应了TBBPA的致毒时间和解毒过程。低浓度TBBPA暴露条件下，作为轻微氧化压力的自适应机制，SOD和GST活性迅速被诱导激活用于抵消氧自由基对生物体产生的氧化损伤。暴露12～48 h过程中，各浓度组SOD和GST活性普遍高于对照组水平，此时为抗氧化酶的解毒过程。至暴露96 h后，各浓度组SOD和GST活性均趋于对照组水平，表明此时桡足类体内氧化损伤基本得到补偿，生物体回归正常生理状态。

谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)作为抗氧化防御系统第二阶段的解毒酶，能够及时清除细胞内的氧自由基，维持细胞内环境的氧化还原态的稳定[26]。GPx可将还原型谷胱甘肽(GSH)催化成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，结合机体过量H2O2，从而有效避免氧化胁迫。先前研究表明，不同浓度TBBPA暴露能够持续诱导激活鲫鱼(Carassius auratus)血清中的GPx活性，尤其在实验初期(0～5 d)，鲫鱼血清中的GPx活性显著高于对照组[8]。王素敏等[27]研究了不同浓度TBBPA暴露对罗非鱼(Mossambica tilapia)肝脏内GSH含量的影响，结果显示高浓度TBBPA使罗非鱼肝脏内GSH含量显著上升，超过一定浓度后，GSH含量迅速下降。本研究中GPx活性与GSH含量呈整体负相关趋势。TBBPA 96 h暴露过程中，各浓度组太平洋真宽水蚤GPx活性始终维持在较高水平，催化H2O2形成H2O，避免过量H2O2未被及时清除继而与O2-反应生成毒性更大的羟基自由基。虽然GSH含量在暴露初期由于毒物兴奋效应[7]轻微上升，作为底物由GPx催化形成GSSG，清除机体大量H2O2。至暴露96 h时，各浓度组GSH含量均显著低于对照组，对比GPx活性实验结果，此时桡足类体内仍存在大量H2O2，GPx活性始终高于对照组水平，GPx持续催化GSH为GSSG，因此GSH含量逐渐降低。

总之，TBBPA对太平洋真宽水蚤的急性毒性极高，并与若干海洋甲壳类处于同一数量级。同时，TBBPA暴露还能显著影响太平洋真宽水蚤的SOD、GST、GPx活性以及GSH含量。作为一个复杂的解毒机制，桡足类的抗氧化防御系统在应对外源污染物暴露时会产生一系列生理响应措施。低浓度污染物处理时，由于毒物兴奋效应，抗氧化防御酶系SOD、GST、GPx和非酶物质GSH的活性或含量均显著上升，呈现剂量-效应关系；当随着污染物浓度增大，超过抗氧化防御系统的解毒能力时，目标桡足类体内过量ROS堆积，继而产生氧化损伤。因此桡足类体内抗氧化水平的变化可作为海洋生态早期预警的生化指标，对海洋水质监测具有重要意义。

致谢：感谢中国海洋大学朱丽岩教授对实验设计和论文写作的悉心指导，郝雅、陈学超同学在文章修改过程中提供的大量帮助，感谢审稿专家提供的宝贵意见。

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Acute Toxicity and Oxidative Stress of Tetrabromobis-phenol A to Eurytemora pacifica

Gong Wenjing1,2, Zhu Liyan1,*, Hao Ya1, Jiang Tiantian1, Han Cui1

1. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China 2. College of Forensic and Medical Technology, Medical College of Jining, Jining 272067, China

Received 5 May 2016 accepted 17 May 2016

Tetrabromobisphenol A (TBBPA) is one of the most widely used brominated flame retardants. To evaluate the toxic effects of TBBPA on the marine ecosystem, the acute toxicity of TBBPA and its oxidation stress were examined in marine copepod species (Eurytemora pacifica) over 96 h’s exposure. The 96 h median lethal concentration (LC50) of TBBPA to E. pacifica was 178 μg·L-1with 95% confidential interval of 91～306 μg·L-1, and was catagorized as “high-toxic”. The activities of superoxide dismutase (SOD), glutathione transferase (GST), peroxidase (GPx), and the contents of glutathione (GSH) were also detected. Under experimental concentration (<35.6 μg·L-1) of TBBPA, the activities of the three antioxidant enzymes increased significantly in the early exposure compared with those in the controls, which suggested that the antioxidant enzymes could protect the animals from oxidative damage. Subsequently, the activities of SOD and GST decreased to the control levels with increased exposure time. The GSH content increased slightly at first, and became significantly lower than those in the controls after 48 h TBBPA exposure. The results indicated that the activities of SOD, GST, GPx and the GSH content were sensitive to TBBPA exposure and could be the potential biomarkers in marine ecological early warning.

tetrabromobis-phenol A; Eurytemora pacifica; acute toxic; antioxidant defense system

国家水体污染控制与治理科技重大专项(2012ZX07501-003-06)；国家自然科学基金(31172412)；国家自然科学基金(31572621)

巩文静(1989-)，女，博士研究生，研究方向为生态毒理学，E-mail: 108092392@qq.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: smfysw@ouc.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160505001

2016-05-05 录用日期：2016-05-17

1673-5897(2016)4-232-07

X171.5

A

简介：朱丽岩(1965—)，女，海洋生物学博士，教授，硕士研究生导师，主要研究方向为海洋浮游动物生物学、海洋无脊椎动物生态毒理学，发表学术论文60余篇。

巩文静, 朱丽岩, 郝雅, 等. 四溴双酚A对太平洋真宽水蚤的急性毒性及氧化胁迫[J]. 生态毒理学报，2016, 11(4): 232-238

Gong W J, Zhu L Y, Hao Y, et al. Acute toxicity and oxidative stress of tetrabromobis-phenol A to Eurytemora pacifica [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 232-238 (in Chinese)