H2O2致大鼠RTE细胞系氧化应激作用及GSH保护作用的体外研究

余锦波，邹鉴，朱雨晴，朱家力，杜晶，李潇潇，郭晴，杨旭

华中师范大学生命科学学院，武汉 430079



H2O2致大鼠RTE细胞系氧化应激作用及GSH保护作用的体外研究

余锦波，邹鉴，朱雨晴，朱家力，杜晶，李潇潇，郭晴，杨旭

华中师范大学生命科学学院，武汉 430079

许多具有氧化作用的空气污染物，均能使细胞产生氧化损伤，使胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)含量上升。而TSLP是一种启动过敏性炎症的重要因子，会导致哮喘等疾病发生率的上升。在本研究中用过氧化氢(H2O2)模拟具有氧化作用的空气污染物进行染毒，研究细胞氧化应激水平的变化，并讨论还原型谷胱甘肽(GSH)对细胞受氧化损伤的保护作用。将大鼠支气管上皮细胞(RTE)分组培养，每组设置6个平行实验，分别用低、中、高剂量H2O2染毒3 h；高剂量设置1个重复，作为保护组，在染毒前用GSH保护2 h。结果显示，高剂量组H2O2(3.2 mmol·L-1)染毒的细胞，其细胞活力下降(P<0.01)，丙二醛(MDA)水平上升(P<0.01)，TSLP水平上升(P<0.05)，与之相比，用GSH保护后的同剂量染毒组，上述指标得到全面缓解(P<0.01)。这表明高浓度的H2O2会损伤细胞活力，并使MDA及TSLP水平上升，而GSH对TSLP及MDA的升高有极显著的抑制作用，即对细胞有一定的保护作用。

过氧化氢；大鼠支气管上皮细胞；RTE细胞；谷胱甘肽；胸腺基质淋巴细胞生成素；丙二醛；氧化损伤

目前发现，多种空气污染物及其类似物，如甲醛[1-4]、碳纳米管[5-8]、PM2.5[9-11]等都能通过吸入的方式，对呼吸系统造成不同程度上的氧化损伤[12]，使活性氧族(ROS)指标升高，还原型谷胱甘肽(GSH)指标降低。然而，对呼吸系统受到氧化损伤的后续分子事件的研究尚不多见。

丙二醛(MDA)是生物体内，脂过氧化的降解产物，是多种毒物引起的氧化性脂损伤的指示剂，而自由基浓度的提高可以引起脂的过氧化[1,13]。

胸腺基质淋巴生成素(TSLP)是一种由上皮细胞分泌的新型细胞因子，TSLP可以使树突状细胞活化、分化、成熟和迁移，进而支持B淋巴细胞的生长、分化以及Th2细胞增殖，对Th1/Th2免疫平衡起着重要的调控作用[14]。众多研究表明，TSLP可以上调Th2淋巴细胞系统功能，使IL-4和IgE抗体表达上调，形成获得性过敏性体质。可以认为，TSLP是一种启动过敏性炎症的重要因子[15-19]。

H2O2，是大气中主要的过氧化物之一[20-22]。并且可以产生氧自由基，参与氧化应激，损伤蛋白质、脂等生物分子。因此，本实验以H2O2模拟具有氧化作用的大气污染物，对RTE细胞进行染毒，并用GSH作为阻断剂，处理处理高剂量组细胞，然后测定细胞的氧化应激反应，考察细胞活力(MTT比色法)以及MDA、TSLP两种生物标记物含量的变化。借此研究具有氧化作用大气污染物(H2O2模拟)，对细胞的影响以及GSH的保护作用[23]，并探讨细胞TSLP水平变化的原因，与可能导致的结果。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试剂和仪器

GSH试剂盒(南京建成)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、H2O2、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)均为国产分析纯(上海国药集团化学试剂有限公司)；2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA荧光染料，99.9%，Sigma公司)；MEM培养液(武汉普诺赛生命科技有限公司)等。

低温冷冻离心机(Eppendorf-5415R，武汉)；全波长酶标仪(北京普朗新技术有限公司-DNM-9602，北京)；荧光酶标仪(Biotek-FLx800，美国)等。

1.2 GSH与H2O2染毒液的配制

将GSH标准储备液溶，用MEM培养基稀释后，配制成1 mmol·L-1试剂。再用MEM培养基将1 mmol·L-1GSH稀释至40 μmol·L-1备用。将10 mmol·L-1的H2O2用MEM培养基分别稀释至0.05 mmol·L-1、0.2 mmol·L-1、0.8 mmol·L-1、3.2 mmol·L-1浓度备用[24]。

1.3 H2O2、GSH联合处理实验细胞

所用RTE细胞由武汉普诺赛生命科技有限公司提供，是一种梭形贴壁细胞，如图1所示。取配制好的50 μL GSH溶液与50 μL MEM培养基混合，对保护组细胞进行培养，其余组用100 μL MEM培养，均培养3 h。3 h后，弃掉上述培养液，用PBS清洗3次，再用上述浓度梯度的H2O2溶液继续培养2 h。

1.4 细胞活力(MTT法)水平的测定

①将RTE细胞以1×105的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，培养72 h。②弃去培养液，按上文所述方式进行联合染毒。③弃去染毒液，用高压灭菌的PBS对细胞进行3次清洗。④每孔加入新鲜培养液90 μL，再添加10 μL、5 mg·L-1的MTT、37oC培养4 h。⑤小心弃去培养液，加入DMSO(100 μL·孔-1)，5 min后在490 nm波长下测定吸光度[25-26]。

图1 大鼠支气管上皮细胞(RTE细胞)的普通光学显微镜图片Fig. 1 Image of rat tracheal epithelial (RTE) cells under optical microscope

1.5 丙二醛(MDA)水平的测定

①将RTE细胞以1×106密度接种于6孔细胞培养板中，每孔2 mL，培养72 h。②弃去培养液，按上文所述方法，将GSH以及染毒溶液的量扩大为2 mL进行联合染毒。③弃去染毒液，用高压灭菌的PBS对细胞进行3次清洗。④用胰酶消化细胞，然后用PBS清洗3次。⑤再用1 mL PBS重悬细胞。⑥采用超声破碎细胞的方法将细胞破碎，取上清液备用。⑦配制0.6%的巴比妥酸(TBA)。⑧取细胞破碎离心后的上清液0.5 mL加入2 mL 0.6%TBA，并沸水浴15 min。⑨冷水冷却后取1 mL溶液离心。⑩取200 μL上清液加入酶标板，在532 nm、450 nm、600 nm处测吸光度。⑩按CMDA=6.45(D532-D600)-0.56D450，计算出每管样品中MDA的浓度C(μmol·L-1)[27]。

1.6 胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)水平的测定

按上述测定MDA的同样方法准备样品。严格按TSLP ELISA试剂盒说明操作，并按要求处理数据。

1.7 统计学分析

用Origin8软件对实验数据作图，应用SPSS-11统计软件进行ANOVA分析，然后用LSD检验法检验染毒组与空白组之间的差异，统计学检验水平α=0.05。

2 结果(Results)

2.1 细胞活力(MTT法)的变化

MTT吸光度与细胞活力正相关，图2为染毒后细胞活力的变化。实验结果表明，H2O2染毒在低剂量组(0.05 mmol·L-1)促进了细胞生长，使其活力升高；但在中(0.20 mmol·L-1、0.80 mmol·L-1)、高(3.2 mmol·L-1)浓度组，细胞活力极显著降低。在高浓度组，GSH表现出的保护作用极显著。但是，经过GSH保护作用的高剂量组细胞，其细胞活力较对照组细胞仍极显著降低。

2.2 丙二醛(MDA)水平的变化

MDA值与细胞氧化损伤程度正相关，图3为染毒后MDA浓度的变化。实验结果表明，尽管在中、低剂量组，MDA含量未出现显著性提高，但在高剂量组，MDA含量极显著提高，即细胞氧化损伤严重。加GSH的保护组与未加GSH的高剂量组间差异极显著，与对照组差异间差异显著，说明GSH起到了保护细胞，减缓氧化损伤的作用。

图2 H2O2对RTE细胞活力(MTT比色法)的影响注：*、**与空白对照组相比，P<0.05、P<0.01；## 加还原型谷胱甘肽(GSH)与未加GSH两个高浓度组相比，P<0.01。下同。Fig. 2 Effects of H2O2 on RTE cell viablity (MTT colorimetry)Note:*,**, compared with control group, P<0.05, P<0.01, respectively; ##, compared between the GSH pretreatment group and the single H2O2 treatment, P<0.01.

图3 H2O2对RTE细胞丙二醛(MDA)水平的影响Fig. 3 Effects of H2O2 on the MDA contents in RTE cells

2.3 胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)水平的变化

图4为染毒后TSLP浓度的变化。在中、低剂量组，TSLP含量与对照组并无显著性差异，但高剂量组差异显著，且GSH的保护作用极显著。采用了GSH保护的高剂量组与其他所有剂量组均有显著性差异(P<0.05)，并且和对照组无显著性差异。

3 讨论(Discussion)

结果表明H2O2对RTE细胞有较强的毒性效应，并且存在一定的剂量-反应关系。低剂量的H2O2会促进细胞活力上升，且此时细胞氧化损伤程度与TSLP含量并无显著性上升；中剂量的H2O2能使细胞活力显著下降，但细胞所受氧化损伤程度与TSLP含量并无明显变化；高剂量的H2O2使细胞活力显著下降，细胞所受氧化损伤程度显著性上升，且TSLP含量也显著升高，但在GSH的保护下，以上指标均极显著地全面缓解。

图4 H2O2对RTE细胞胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)含量的影响Fig. 4 Effects of H2O2 on thymic stromal lymphopoietin (TSLP) content in RTE cells

生物体在正常代谢过程中会产生MDA，此时机体的氧化代谢处于平衡水平。并且生物体具有一定的应激能力，可以适应较弱的刺激。但在遭受外界较强刺激的情况下，机体会发生氧化应激反应，反映出剂量-反应效应，并导致MDA过量产生从而打破平衡。而在本实验中，TSLP含量的上升，可能是由于外界H2O2刺激直接导致的，也有可能是由于MDA的过量产生而引发的。

本实验已经验证，高剂量的H2O2会导致MDA与TSLP含量的显著上升，同时GSH可以有效缓解以上指标的上升。而TSLP含量上升的具体原因还有待探讨。Nakamura等[28]的研究结果表明，高剂量的MDA会引起TSLP含量的上升。借此我们预测了一条分子通路：高剂量的H2O2引起细胞内MDA水平上升，而细胞内MDA水平的上升进一步引起了TSLP水平的上升。但本实验无法确定外源性的H2O2是否也直接导致了TSLP含量的上升。

有研究表明，TSLP作为一种过敏性炎症的重要启动因子，它能够活化CD11c+树突状细胞(dendritic cell, DC)，被活化的细胞一方面能够表达用来聚集Th2的化学因子TARC和MDC，另一方面能够启动CD4+T细胞前体向Th2转化。而Th2细胞能够产生IL-4、IgE，从而使机体获得过敏性体质[14-19]。而本实验已经验证，GSH作为一种机体内的常见还原剂，在机体受到H2O2的损伤时，可以有效降低细胞氧化损伤程度，并缓解TSLP的上升，从而避免上述反应的发生。本实验所推测的分子通路如图5所示，橙色框内为本实验所验证内容。而TSLP水平上升之后的一系列分子事件，可通过前人进行的一系列实验及综述而推出。

图5 可能获得过敏性体质的分子通路之一Fig. 5 A possible molecular pathway to acquire allergic constitutions

综上所述，我们认为，一些能够对机体造成严重氧化损伤的空气污染物，因为上调了机体氧化应激水平，可能导致TSLP的水平随之上调，也可能这些空气污染物直接导致了TSLP水平的上升，并由此增强Th2细胞的表达，从而使机体在后天获得过敏性体质。

高剂量的H2O2不仅会使细胞活力降低，同时使细胞内MDA含量上升，这一结果证明细胞受到了氧化损伤；而且细胞内TSLP含量上升，TSLP会进一步启动一系列的分子事件，最终可能导致机体获得过敏性体质。而GSH可以有效降低细胞的氧化损伤程度，抑制细胞内TSLP含量的上升，从而对上述分子通路起到阻断作用。

致谢：本研究获得国家自然科学基金面上项目“PM2.5和甲醛复合暴露致小鼠哮喘样病变分子机制的研究”(21577045)资助，特此致谢。

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An in Vitro Study on Oxidative Stress Induced by H2O2and Protective Effect of GSH in Rat Tracheal Epithelial Cell

Yu Jinbo, Zou Jian, Zhu Yuqing, Zhu Jiali, Du Jing, Li Xiaoxiao, Guo Qing, Yang Xu*

School of Life Science, Central China Normal University, Wuhan 430079, China

Received 9 March 2016 accepted 21 April 2016

It has been acknowledged that many oxidative air pollutants can cause the oxidative stress and increase the levels of thymic stromal lymphopoietin (TSLP). TSLP, a kind of important allergic disease initiator, can lead to higher incidence of diseases such as asthma. In this study, H2O2was used to simulate the oxidative pollutants to stimulate cells, in order to study the changes of oxidative stress level and the protective effects of GSH. The rat tracheal epithelial (RTE) cells were cultured in six parallel test groups, including the low, medium and high dose groups, and a repeat high dose group for the protection effect was treated with GSH for 2 h before the 3 h-H2O2-exposure. The MDA (P<0.01) and TSLP (P<0.05) levels increased while the cell viability were decreased (P<0.01) in the high dose group (3.2 mmol·L-1). After the pretreatment of GSH, the changes of MDA and TSLP levels, and the cell viability decreased, compared with those of the same dose H2O2group. It is indicated that high dose H2O2can damage cell viability and increase the levels of MDA and TSLP, while the GSH can ameliorate the damage and protect the cells. Keywords: H2O2; rat tracheal epithelial cell; glutathione (GSH); thymic stromal lymphopoietin (TSLP); oxidative damage

国家自然科学基金重点项目(51136002)

余锦波(1995-)，男，本科生，研究方向为环境毒理学，Email: 646488921@qq.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: yangxu@mail.ccnu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160309002

2016-03-09 录用日期：2016-04-21

1673-5897(2016)4-124-06

X171.5

A

简介：杨旭(1954-)，男，医学博士，教授，博士生导师，从事分子毒理学研究20余年。

余锦波, 邹鉴, 朱雨晴, 等. H2O2致大鼠RTE细胞系氧化应激作用及GSH保护作用的体外研究[J]. 生态毒理学报，2016, 11(4): 124-129

Yu J B, Zou J, Zhu Y Q, et al. An in vitro study on oxidative stress induced by H2O2and protective effect of GSH in rat tracheal epithelial cell [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 124-129 (in Chinese)