11个苜蓿品种种子寄藏真菌检测与鉴定

先米西努尔·肉孜，李克梅，阿提开姆·如则，古丽巴哈尔·热合买提

(新疆农业大学农学院/新疆农林有害生物监测与防控重点实验室，乌鲁木齐 830052)



11个苜蓿品种种子寄藏真菌检测与鉴定

先米西努尔·肉孜，李克梅，阿提开姆·如则，古丽巴哈尔·热合买提

(新疆农业大学农学院/新疆农林有害生物监测与防控重点实验室，乌鲁木齐 830052)

【目的】分离和鉴定不同产地的苜蓿种子寄藏真菌，明确其寄藏真菌种类和带菌率，为苜蓿的引进、抗病育种及生产中苜蓿病害综合防治提供理论依据。【方法】采用平皿测定方法，分别对来自国内外不同区域的11个苜蓿品种，进行种子寄藏真菌分离、纯化和鉴定。【结果】共检测到种子寄藏真菌13属16种。其中来自国外的阿尔冈金、4030、金皇后、巨能2号、超音速等品种带菌率较高。黑曲霉(Aspergillusniger)、细交链孢(Alternariaalternata)是优势种群。【结论】苜蓿种子携带真菌现象极为普遍，经消毒处理的种子带菌率显著降低，且经过表面消毒处理的种子，与未进行表面消毒种子检出寄藏真菌种类存在显著差异。

苜蓿；种子；寄藏真菌；种类

0 引 言

【研究意义】苜蓿是世界上最重要的、栽培最早、分布面积最大的多年生优质豆科牧草，因其营养价值高、适口性好，素有“牧草之王”的美誉[1]。随着我国苜蓿栽培面积的不断扩大，尤其是苜蓿在我国西部开发、退耕还草、种草养畜、改善生态环境等方面的重大作用，苜蓿必将成为我国种植结构调整的切入点和农村经济发展新的增长点[2]。 种子作为高等植物的繁殖器官可携带大量危害种苗或植株的真菌、细菌、病毒等微生物和线虫[3]，它既是病害的载体又是受害者。在这些微生物中，真菌对种子的质量影响最大[4-6]。种子品质是提高作物产量和质量的重要物质基础。对种子进行带菌检测是保证种子质量的重要内容之一[7]。近年来随着种子市场的开放，种子贸易量的迅速增长，带菌种子已成为病害跨地区传播流行的重要原因，因此对种子进行健康检测是保证种子质量，及控制种传病害最方便有效的方法，可有效地防治病害的发生，因此，对苜蓿种子进行带菌检测和种子处理是生产上减低种子带菌率、有效控制种子病原菌扩大传播、培育壮苗、增加草场建植持久性的重要措施，对建立苜蓿病害综合防治体系，将危害降到最低限度，促进苜蓿产业的可持续发展和生态环境建设有重大意义。【前人研究进展】研究表明，种子带菌是普遍现象，李春杰等[8]曾对国内38个苜蓿种子样品进行了系统的种带真菌检测研究，参试种样不经过表面消毒测定出21种25个真菌分离物， 李克梅等[9]用吸水纸检验法，对新疆苜蓿品种种子及植物组织残体上进行种带真菌检测，总共测定了21种真菌，种子分为经过表面消毒(0.1%升汞消毒)只检测到7种真菌，而不经表面消毒苜蓿种子检测到13种真菌。陈焘等[10]对来自青海的5个不同收获年份的老芒麦种样进行种带真菌研究(NaClO消毒处理)测定了12种种带真菌。【本研究切入点】近年来，随着国外作物种子的大量引进，传入新疆的植物病害种类逐渐增多。由于苜蓿品种和产地不同，消毒方法不同，检测方法也有差异，故常造成带菌种类检测结果的差异。分离鉴定苜蓿种子寄藏真菌，明确苜蓿种子寄藏真菌检测的适宜方法。【拟解决的关键问题】研究针对来自美国、加拿大、澳大利亚、中国新疆、黑龙江、宁夏、甘肃等11个来自国内外不同区域的苜蓿种样，进行种子表面不消毒和消毒处理，分别检测寄藏真菌种类鉴定。比较两种处理方式对种子寄藏真菌种类检测结果的影响，为选择合适的种子寄藏真菌检测方法提供依据。同时，确定引进的苜蓿种子带菌情况，可为种子生产、储藏加工、包衣剂的设计、种子消毒方式的选择，及对控制苜蓿种传病害的发生、危害及采取有效防治措施提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试11份苜蓿种样分别来自美国、加拿大、澳大利亚，中国新疆、黑龙江、宁夏、甘肃。表1

表1 苜蓿种样来源

1.2 方 法

1.2.1 种子寄藏真菌的检测

1.2.1.1 未处理种子寄藏真菌检测

将供试的不同苜蓿品种不经表面消毒分别随机选取10粒种子均匀摆放于含有100 mg/L氯霉素的9 cm直径PDA平板上，5皿为一个重复，共设4个重复，置25℃恒温黑暗培养。第3 d挑取不同颜色、形状的菌丝进行纯化培养，第7 d时镜检记录每粒种子上分离出真菌种类及分离频率。

1.2.1.2 表面消毒种子寄藏真菌检测

采用李春杰的方法[8]，稍有改动。每个品种随机选取200粒种子， 1%NaClO溶液浸泡消毒10 min，无菌蒸馏水充分洗涤5次，用灭菌滤纸吸干种子表面的水分[11]。用经火焰灼烧灭菌的镊子随机选取10粒种子，等距离置于含有100 mg/L氯霉素的9 cm 直径PDA平板上，每皿10粒，5皿为一重复，共设4个重复，25℃ 恒温黑暗培养。第7 d时记录每粒种子上分离出真菌种类、检出率。

计算公式如下：

带菌率(%)=(带菌种子总数/检测种子总数)×100。

某菌检出率(%)=(带某类菌种子数/带菌种子总数)×100。

1.2.2 种子寄藏真菌的鉴定

将从种子分离得到的真菌做标记并分别进行纯化、转管保存和镜检。根据真菌培养性状和显微形态特征，依据Barnett H.L.和Hunter B.B.(沈崇尧译)《半知菌属图解》[12]、张中义《植物病原真菌学》[13]、邵力平等《真菌分类学》[14]等资料的描述将其鉴定到种，个别真菌鉴定到属。

2 结果与分析

2.1 未处理种子寄藏真菌检测

未处理种子带菌率为13.5%～87.5% ，平均为36.9% 。不同种样带菌率差异显著(P<0.05)，其中来自加拿大的3份种样带菌率均较高，阿尔冈金带菌率高达87.5%，4030、金皇后带菌率分别为60%和51.5%；美国的巨能2号、澳大利亚的超音速种子带菌率分别为45.5%和40%，上述种样带菌率均显著高于6个国内种样。表2

供试11个未经处理的苜蓿种子检出寄藏真菌9属12种真菌。分别为4种曲霉(黑曲霉Aspergillusniger、黄曲霉Aspergillus.flavus、聚多曲霉Aspergillus.sydowii、杂色曲霉Aspergillus.Versicolor)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、桃色拟青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐离蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛壳(Chaetomiumelatum)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、黑色葡萄状穗霉(Stachybotrysatra)、细交链孢(Alternariaalternata)、镰刀菌(Fusariumsp)。

未处理种子中各种真菌的分离频率为0%～75.5%，检出率最高的是黑曲霉(Aspergillus niger)，高达75.5%，最低的是高大毛壳(Chaetomiumelatum)，仅2.3%。其中11个种子样品中检出黑曲霉，8个样品中检出意大利青霉，6个样品中检出黄曲霉、细交链孢，5个样品中检出镰刀菌。表3

2.2 表面消毒种子寄藏真菌检测

经表面消毒处理种子寄藏真菌带菌率为3.5%～46.5% ，平均为19.6% 。其中来自加拿大的阿尔冈金、4030、美国的巨能2号带菌率分别是46.5%、36%、28.5%，高于其他种样。表2

经表面消毒处理的种子中分离鉴定出9属12种真菌。分别为4种曲霉(黑曲霉Aspergillusniger、黄曲霉Aspergillus.flavus、聚多曲霉Aspergillus.sydowii、杂色曲霉Aspergillus.Versicolor)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、轮枝菌(Verticilliumsp)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、细交链孢(Alternariaalternata.)、镰刀菌(Fusariumsp.)。与未经处理种子检测到的寄藏真菌相比，枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、轮枝菌(Verticilliumsp.)4种菌在经处理的种子上检测到，而未经处理种子中检测到的桃色拟青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐离蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛壳(Chaetomiumelatum)、黑色葡萄状穗霉(Stachybotrysatra)4种菌在种子表面消毒处理后未检测到。表3

各种真菌的分离频率为1.1%～75%。分离频率最高的是细交链孢(Alternariaalternata，75%)最低的是聚多曲霉(Aspergillussydowii，1.1%)。较未经处理的种子，各种真菌经消毒处理带菌率显著降低，且各种真菌的检出率则有差异。

表2 苜蓿种子寄藏真菌带菌率(%)

注：同列不同小写字母表示差异达(P<0.05)显著水平

Note：Different lowercase letter in same line means the test differences are significant (P<0.05)

表3 苜蓿种带真菌种类及检出率

3 讨 论

研究显示，未经表面消毒处理的种子带菌率为13.5%～87.5% ，平均为36.9%，而经消毒处理的种子带菌率为3.5%～46.5% ，平均为19.6%，种子消毒前后的带菌率存在显著差异，说明表面消毒处理可显著减少种子寄藏真菌的带菌率。

11份苜蓿种样共检测到13属16种真菌，但其中枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、轮枝菌(Verticilliumsp.)4种菌在未经处理的种子上未检测到，推测这几种菌可能需要较多的水分才能生长，因未处理的种子是干种子而未能很好的萌发生长；桃色拟青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐离蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛壳(Chaetomiumelatum)、黑色葡萄状穗霉(Stachybotrysatra)4种菌在种子表面消毒处理后未检测到，推测该类菌对表面消毒剂次氯酸钠敏感而被杀死故没有长出。目前针对种子寄藏真菌带菌检测，常用的方法是种子不经处理直接培养检验[7,8]，但这一结果说明，可能直接培养干种子进行带菌检测，可能会使一些对湿度要求高的真菌检测不出来，因而造成漏检的现象，这是在种子寄藏真菌检测中值得注意的问题。

苜蓿不同产地各种样之间以及同产地不同品种之间种子带菌率均存在较大的差异，来自加拿大、美国、澳大利亚的苜蓿种子带菌率相对于国内种子带菌率偏高，而新疆、宁夏、甘肃等干旱地区种子带菌率则较低。南志标[15]报道沙打旺种子成熟和收打期间产地的湿润度与种子带菌率呈正相关，故外国种子带菌率偏高可能与当地降水较丰富有关。

被检测的国外种子在收集、储存、转运过程中程序多，流程长，更容易沾染和滋生真菌，故建议在加强国外苜蓿种子的带菌检测，尤其是加强一些高危、检疫性的病害的检测，如，苜蓿黄萎病Verticilliumalbo-atrumReinke & Rerthold的检测，或者直接引进经过包衣处理的种子。

有报道认为，对某些作物种子带菌检测的研究发现，表面消毒是必须的[16]，否则根霉等生长迅速的真菌会对生长相对缓慢的植物病原真菌产生抑制作用[17]。但亦有研究表明表面消毒会减少检出的真菌种数和降低检出率[18]。研究结果显示，苜蓿种子检测前是否经表面消毒，对真菌检出种数与检出率有显著影响。选择合适的表面消毒剂是植物无菌操作的重要步骤，提高消毒效果、减轻对植物伤害以及价格低廉是选择表面消毒剂的原则[19]。研究表明，2% NaClO溶液即可起到种子表面消毒的效果，又不影响种子的发芽率，是一种安全、适用的表面消毒处理剂。

种子寄藏真菌并不都是致病菌，对从苜蓿种子分离到的真菌开展其致病性测定研究，进一步区分致病菌和腐生菌，评价各种寄藏真菌对苜蓿种子发芽和出苗的影响，并对致病菌开展种子处理研究，最终达到防止病害传播和减轻苗期病害的目的。

4 结 论

供试11份苜蓿种子共检出寄藏真菌13属16种。分别为4种曲霉(Aspergillusniger、Aspergillus.flavus、Aspergillus.sydowii、Aspergillus.Versicolor)、意大利青霉(Penicilliumitalicum)、桃色拟青霉(Paecilomycespersicinus)、根腐离蠕孢(Bipolarissorokiniana)、高大毛壳(Chaetomiumelatum)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、黑色葡萄状穗霉(Stachybotrysatra)、细交链孢(Alternariaalternata.)、镰刀菌(Fusariumsp)、枝孢霉(Cladosporiumsp.)、粘鞭霉(Gliomastixmurorum)、簇孢匐柄霉(Atemphyliumbotryosum)、轮枝菌(Verticilliumsp)。其中来自国外的阿尔冈金、4030、金皇后、巨能2号、超音速等品种带菌率较高。是否经过表面消毒处理的种子病菌检出种类有差异，可能与病菌的带菌部位和病菌萌发生长需要的湿度条件不同有关。

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Fund project:Supported by Special funds for Agricultural scientific research in the national public welfare industry (201303057) and Key Laboratory of grassland resources and ecology in the Xinjiang Uygur Autonomous Region (XJDX0209-2012-01)

Detection and Identification of Eleven Kinds of Alfalfa Seed-Borne Fungi

Xianmixinuer Rouzi, LI Ke-mei, Atikaimu Ruzi, Gulibahaer Rehemaiti

(Key Laboratory of Monitoring and Controlling Agricultural and Forestry Pests /CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 The project aims to isolate and identify the borne fungi on alfalfa seeds from different origins in order to provide a theoretical basis for clearing the fungal species, infection rate and the introduction of alfalfa, breeding for integrated control of alfalfa diseases in disease resistance breeding and production.【Method】Seed-borne fungi and disinfection effect of eleven alfalfa species from different origins at home and abroad were determined by means of perti dish testing.【Result】The results showed that 16 fungi species that belonged to 13 genera were carried by rapeseeds. The carrier rate of species from home and abroad was higher.Aspergillusniger,Alternariaalternatawere the main seed-borne pathogens.【Conclusion】Alfalfa seed carrying the fungus is a common phenomenon, the disinfection of seed infection rate was significantly reduced, and there are significant differences between the seeds after disinfection those without disinfection.

alfalfa；seed；borne fungi；species

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.07.015

2016-02-20

国家公益性行业农业科研专项(201303057)；新疆维吾尔自治区草地资源与生态重点实验室项目(XJDX0209-2012-01)

先米西努尔·肉孜(1989-),女, 新疆乌鲁木齐人，硕士研究生，研究方向为牧草病害及防治，(E-mail)840300914@qq.com

李克梅(1973-),女，江苏如皋人，副教授，博士，研究方向为牧草病害，(E-mail) lindali1118@sina.com

S435.4

A

1001-4330(2016)07-1281-07