2型和11型鸭疫里默氏菌二价灭活苗的研制

程龙飞，林群群，许利娜，施少华，陈翠腾，仇微红，万春和，陈红梅，彭春香，叶贺佳，黄 瑜

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州350013；2.广州市华南生物药品有限公司，广州 511300）

·研究论文·

2型和11型鸭疫里默氏菌二价灭活苗的研制

程龙飞1，林群群1，许利娜2，施少华1，陈翠腾1，仇微红2，万春和1，陈红梅1，彭春香1，叶贺佳2，黄 瑜1

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州350013；2.广州市华南生物药品有限公司，广州 511300）

为研制血清2型和11型鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）二价灭活疫苗，以RA1325株（2型）和RA1229株（11型）为菌种，经培养、灭活、浓缩，混合后制成二价灭活油乳剂疫苗。将疫苗皮下接种7日龄番鸭，免疫后7、14、21、56、63、70、77 d进行攻菌试验，测定疫苗的免疫原性。免疫后每隔7 d用ELISA方法测定血清中的抗体。结果表明，疫苗免疫后14 d产生良好保护，保护率超过80%，免疫持续期可达60 d。免疫后14 ～ 63 d抗体效价处于较高水平，说明研制的二价灭活疫苗能对血清2型和11型RA引起的鸭疫里默氏菌病产生良好的预防效果。

鸭疫里默氏菌；2型；11型；二价灭活疫苗；保护指数

鸭疫里默氏菌病，又名鸭传染性浆膜炎，是由鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）感染引起的各品种雏鸭和雏鹅的一种急性或慢性败血性传染病，导致发病禽死亡，耐过禽生长不良，饲料转化率降低，造成巨大的经济损失[1]。生物安全模式饲养、疫苗接种结合适当的药物应用是预防该病最经济有效的方法。国际上公认的RA血清型有21种[2]，我国流行的RA血清型多达15种[3]。不同血清型菌株之间缺乏足够的交叉保护，只有选择与流行菌株相同血清型菌株制备的灭活苗才能提供最佳的免疫保护[4]。血清11型RA在我国流行的报道最早见于1999年，程龙飞等[5]发现2006年以来，11型RA的流行呈逐年上升的趋势，2012年，血清2型和11型合计已超过流行菌株的80%。为适应RA的流行新情况，本研究对血清2型和11型RA二价灭活疫苗实验室制品进行了研制。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鸭疫里默氏菌RA1325株（2型）和RA1229株（11型），作为灭活疫苗的生产和检验用菌种，均保存于福建省农业科学院畜牧兽医研究所。

1.1.2 培养基 改良TSA平板和改良LB[6]。

1.1.3 实验动物 1日龄番鸭，雌雄不限，体重60 ～70 g，隔离饲养至所需日龄。

1.2 方法

1.2.1 灭活油乳剂疫苗的制备 两株细菌分别培养、计数、灭活、灭活检验、浓缩，混合制备水相，与油佐剂按常规方法制成灭活油乳剂疫苗[6]。

1.2.2 疫苗的无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行常规的无菌检验。取3块改良TSA平板，每个平板接种疫苗300μL，于烛缸中37℃恒温箱培养48 h后观察。

1.2.3 疫苗的安全检验 对7日龄番鸭分别进行1次单剂量接种、单剂量重复接种（间隔14 d）、超剂量（2倍量）接种试验，每个试验用鸭10羽，观察7 d，察看并记录试验鸭的精神状态、采食、排粪、眼鼻分泌物等，观察期结束后全部鸭处死剖检，检查注射部位的疫苗吸收情况。

1.2.4 疫苗的免疫期测定 7日龄番鸭随机分为2组，实验组180羽，对照组130羽。免疫组鸭每只皮下注射疫苗0．3 mL，对照组鸭每只皮下注射生理盐水0．3 mL，同条件隔离饲养。免疫后7、14、21、56、63、70、77 d，取免疫鸭12羽和对照鸭8羽，每羽注射RA1325株0．5 mL；另取免疫鸭12羽和对照鸭8羽，每羽注射RA1229株0．5 mL，观察10 d。记录各组死亡数量，统计各免疫组的保护率。当对照组死亡率未达到100%时，以保护指数[7]来计算。保护指数＝（对照组死亡率－试验组死亡率）／对照组死亡率×100%

1.2.5 疫苗免疫后的抗体检测 7日龄番鸭随机分为2组，每组20羽。实验组鸭每只皮下注射疫苗0．3 mL，对照组鸭每只皮下注射生理盐水0．3 mL，同条件隔离饲养。每隔7 d每组随机取12羽，颈静脉采血分离血清。分别以RA1325株和RA1229株的全菌裂解液为包被抗原，测定抗体效价[8]。

2　结果

2.1 疫苗无菌检验 常规无菌检验未发现细菌生长。3个改良TSA平板亦无菌生长，说明无菌检验合格。

2.2 疫苗安全检验 观察期内各安全检验组实验鸭精神良好，采食、排粪正常，眼鼻无异常分泌物。观察期结束后，实验鸭处死剖检，注射局部疫苗吸收良好，无红肿硬结出现。

2.3 免疫持续期 免疫后7 d，免疫组开始产生保护，但保护率不高。免疫后14 d和21 d，免疫组对两株菌的攻击均能提供80%以上的保护，最高达91．6%。免疫后56 d即番鸭63日龄开始，提高攻菌数，仍然无法造成对照组100%的死亡率，故引入保护指数来表示。免疫后56 d和63 d，免疫指数仍然超过80%，因此将免疫持续期确定为免疫后60 d。

2.4 免疫后抗体水平的变化规律 以免疫后天数为横坐标，以抗体效价平均数为纵坐标，绘制的免疫后抗体水平的变化趋势（图1）。对照组鸭血清中的抗体效价始终为阴性。试验组免疫后7 d，血清中开始出现特异性抗体，免疫后28 d，抗体的效价最高，然后逐渐回落，63 d后抗体效价迅速下降。免疫后14～63 d，抗体效价始终保持较高水平。抗体水平与攻菌试验的结果具有一定的相关性。

表1　2型和11型鸭疫里默氏菌攻菌试验结果Table 1 The challenge result of Riemerella anatipestifer sevotype 2 and sevotype 11 to ducks

3 讨论

图1　免疫后抗体水平消长规律Fig.1 The dynamic change of antibody against RA

鸭疫里默氏菌病在我国主要养鸭区均有流行，鹅感染RA也常见报道。不同学者在不同地区发现的流行菌株的血清型并不完全一致，近期研制的疫苗有1型[9]、2型[10]、10型[11,12]、1型和2型[6,13,14]、1型2型和3型三价[4,15]、1型2型和4型三价[16]等灭活疫苗，都能适应不同地区不同时期临床生产的需要。张大丙等[17]确定他们1997年以来收集的菌株中就有血清11型菌株的存在，近几年血清11型鸭疫里默氏菌的报道越来越多[5,18-21]，已成为较常见的血清型之一。本研究试制的血清2型和11型鸭疫里默氏菌二价灭活疫苗，安全性好，注射部位疫苗吸收良好；攻菌试验表明，免疫后7 d即能产生部分保护率，免疫后14 d的保护率超过80%，免疫期长达60 d，适合血清2型和11型流行地区的鸭和鹅使用。

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EFFICACY OF THE BIVALENT INACTIVATED RIEMERELLA ANATIPESTIFER VACCINE CONTAINING SEROTYPES 2 AND 11

CHENG Long-fei1, LIN Qun-qun1, XU Li-na2, SHI Shao-hua1, CHEN Cui-teng1, QIU Wei-hong2, WAN Chun-he1, CHEN Hong-mei1, PENG Chun-xiang1, YE He-jia2, HUANG Yu1
(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China; 2. Guangzhou South China Biological Medicine Co. Ltd., Guangzhou 511300, China)

The purpose of the present study was to develop an inactivated bivalent Riemerella anatipestifer vaccine containing serotypes 2 and 11. Riemerella anatipestifer strains RA1325 (serotype 2) and RA1229 (serotype 11) were cultured, inactivated and concentrated separately and mixed before formulation of a bivalent vaccine. To determine the immunogenicity of the vaccine, seven-day-old Muscovy ducks were subcutaneously vaccinated and then challenged with the live vaccine strains at days 7, 14, 21, 56, 63, 70 and 77 post challenge. Antibodies in serum samples were determined in ELISA every 7 days post vaccination. The results showed that the protection rate was over 80% at day 14 post challenge. The immunity duration of the vaccine was 60 days. The titers of antibodies during 14 to 63 days post vaccination were at a high level. The preliminary results indicated that this bivalent vaccine might be used to prevent serotypes 2 and 11 Riemerella anatipestifer infection in ducks.

Riemerella anatipestifer; serotype 2; serotype 11; bivalent inactivated vaccine; protection index

S852.612

A

1674-6422（2016）05-0025-04

2016-02-17

现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-43）；福建省属公益类项目（2015R1023-2）

程龙飞，男，硕士，研究员，主要从事动物疫病研究

黄瑜，E-mail:huangyu_815@163．com