甜菊糖苷含量跃变的理化特性分析

胡秀英，王仲伟，黄苏珍*

（1.南京农业大学园艺学院，江苏南京210095；2.江苏省中国科学院植物研究所（南京植物园），南京210014）

甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）属菊科（Compositae）甜菊属（Stevia），又名甜叶菊、甜草、甜茶等，原产南美，因植物全株富含甜味物质甜菊糖苷而得名，尤以叶片中含量最高。甜菊糖苷不仅具有甜度高（为蔗糖的300倍）、热量低（仅为蔗糖的1/300）、口感好、稳定性强的特点，还具有降血糖、降血压、预防肥胖和龋齿等药理作用，是一种非常理想的甜味剂[1-3]。因此，甜菊作为一种新兴的糖料作物日益引起人们的关注和重视，并成为继甘蔗、甜菜之后的最具开发价值的“第三糖源”。

我国甜菊自引种成功以来，国内科研、生产单位高度重视，30多年来做了大量的研究工作，培育出一些糖苷含量高的优良品种。甜菊品种的优劣主要在于糖苷含量的高低，在以往研究中发现，甜菊快速生长期、现蕾期、植株开花后糖苷含量呈低-高-低的趋势。中层成叶，上层幼嫩叶和下层衰老的叶片中，糖苷含量递减。甜菊在现蕾期中层叶最多且糖苷含量也最高[4-5]。SOD活力、POD活力、可溶性糖含量和甜菊糖苷含量等也可以作为评价甜菊品种品质的重要标准。而莱鲍迪苷（RA）含量与茎叶总产量等呈显著负相关，甜菊糖苷含量则与各农艺性状间相关均不显著[6-9]。甜菊干叶产量、茎秆产量与糖苷产量无直接的关系，但可以作为衡量推广栽培的标准[10]。本文旨在研究11个甜菊品种糖苷跃变期理化特性与糖苷含量的相关分析，为不同品种甜菊提供精确的采摘期。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验地位于江苏省中国科学院植物研究所甜菊实验苗圃。地理坐标为北纬32°04′，东经118°45′。2015年南京8月天气最高温度：37℃，最低温度：21℃，月平均最高温度：33.06℃，平均最低温度：23.9℃。相对湿度71%～80%，光照强度可达7万lx～9万lx。

1.2 供试材料

试验于2015年7月29日至8月20日进行，供试材料分别为谱星1号、江甜1号、江甜2号、江甜3号、守田3号、中山1号、中山2号、中山3号、中山4号、中山5号和中山6号。

1.3 测定方法

每天上午9点，采摘植株从上第三分支上的一对叶，鲜叶样品一部分置于-80℃冰箱保存，用于测定相关理化指标，一部分在105℃杀青，65℃烘干用于测试甜菊糖苷含量。分别选择为现蕾前10d、前5d、初蕾期及现蕾后5d、现蕾后10d和开花期样品，进行实验。

1.3.1 超氧化物歧化酶（SOD）活力测定 采用氮蓝四唑（NBT）还原法[11]：取甜菊叶片，粉碎、过80目筛。称取0.25 g草粉，加入5 mL 50 mmol/L pH 7.5磷酸缓冲溶液，搅拌均匀后置于4℃下浸提24 h。将滤液于12000 r/min离心20 min，上清液即为SOD粗酶液。

1.3.2 过氧化物酶（POD）活力测定 采用愈创木酚比色法[12]：取200 mL PBS（pH 7.0），加入0.076 mL液体愈创木酚搅拌溶解，再加入0.112 mL 30%的过氧化氢。取3 mL反应液并加入50μL酶液。以PBS为对照调零，其反应时间2 min的A470值计算酶活量。

1.3.3 可溶性多酚的测定 采取Folin-Ciocalteu法[13]：以没食子酸为标准品，对甜菊叶多酚进行测定。甜菊叶多酚70%乙醇提取料液比1∶100，水浴150min。在1mL甜菊叶多酚提取液中加入Folin-Ciocalteu试剂1mL，10%NaCO33mL。在30℃条件下反应2h，测定其在750nm处的吸光度。

1.3.4 可溶性糖含量测定 采取蒽酮比色法[14]：固液比0.33g/mL，水浴温度95℃，提取时间1h。

1.3.5 可溶性蛋白质含量测定 参照曲春香等考马斯亮蓝G-250染色法[15]，取0.1g甜菊的鲜叶，用3mL 0.1 mol/L pH6.8的PBS进行匀浆抽提，于4℃条件下，浸泡4h，在4℃条件下，12000r/min离心10min，上清液为蛋白质粗提液。

1.3.6 糖苷的测定 对Jaitak等[16]的甜菊糖苷提取方法进行了改良和简化，将甜菊叶片烘干磨成细粉，按料液比1∶50（m:v）加入80%（v:v）乙醇，80℃水浴提取30 min，使糖苷快速且充分地溶解。

1.4 数据处理

采用Excel2010和SPSS16.0软件对试验数据进行差异显著性以及变异系数统计分析[19，23]。

2 结果与分析

2.1 甜菊糖苷含量跃变期理化指标分析

2.1.1 不同甜菊品种SOD活力变化规律 SOD是生物体内重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标[17]。

由图1可以看出，甜菊11个品种在现蕾期前除了守田3号和中山2号外差异均不显著，而现蕾后11个品种均呈下降趋势且各期差异显著，其中江甜3号下降幅度最大，现蕾后10d比现蕾时下降了5.22%，守田3号下降幅度最小为0.75%；从SOD酶活性整体水平看，谱星1号、江甜1号、江甜2号、守田3号、中山1号、中山3号和中山6号SOD酶活力较强，其中江甜2号活力水平相对最高，江甜3号、中山2号和中山4号较低，中山5号为最低。

图1 不同甜菊品种超氧化物歧化酶（SOD）活力变化Figure 1.The dynamic changes of superoxide dismutase（SOD）activity in different Stevia materials

2.1.2 不同甜菊品种POD活力变化规律 过氧化物酶（POD）是植物体内重要的呼吸酶类，其活性的高低与植物体内酚类物质的代谢、植物抗性等密切相关。如图2可知，在现蕾期前10d内，过氧化物酶活性没有显著差异，其活性变化基本相同。现蕾后5～10d除了江甜3号未出现明显下降的变化外，其他有明显变化，江甜1号下降最多（20%），江甜2号下降最少（3%）；从POD活性总体水平看，江甜2号POD酶活性水平相对最高，江甜1号POD酶活性水平是最弱的，仅为江甜2号的37.93%。

图2 不同甜菊品种过氧化物酶（POD）活力变化Figure 2.The dynamic changes of peroxidase（POD）activity in different Stevia materials

2.1.3 不同甜菊品种多酚含量变化规律 植物中多酚含量的测定方法有很多，福林酚比色法是植物多酚类化合物常用的测定方法，具有成本低廉、操作简便易行、准确度和精密度高等优点。据图3，只有中山1号、中山4号和中山5号在现蕾时多酚含量最高，中山6号在现蕾前5d达到最高，其他在现蕾前10d就达到最高值。从多酚含量总体水平来看，江甜2号、中山4号和中山6号多酚含量最多。

图3 不同甜菊品种多酚含量变化Figure 3.The dynamic changes of polyphenol content in different Stevia materials

2.1.4 不同甜菊品种可溶性糖含量变化规律 糖类物质与植物抗寒性关系密切，因植物品种不同而含糖量不同，抗寒性强的品种可溶性糖含量偏高，抗寒性弱的品种可溶性糖含量偏低。如图4看出，11个甜菊品种的可溶性糖含量现蕾时最高，之后开始下降。现蕾前中山4号和中山5号可溶性糖含量有明显增加趋势，其余品种差异不明显，同时中山4号和中山5号可溶性糖含量较高；现蕾后除了中山2号，其他品种呈明显下降趋势，中山1号下降（2.91%）最多，中山2号下降（0.04%）最少。

图4 不同甜菊品种可溶性糖含量变化Figure 4.The dynamic changes of soluble sugar content in different Stevia materials

2.1.5 不同甜菊品种可溶性蛋白含量变化规律 可溶性蛋白在细胞内的积累对于降低细胞内溶质的渗透势、平衡原生质体内外的渗透压等具有重要作用。如图5，现蕾前除了江甜1号差异明显外，其他品种差异不明显，现蕾后除了谱星1号、中山2号和中山6号可溶性蛋白质含量不明显，其他差异明显，江甜3号可溶性蛋白质含量下降（2.83%）最多，谱星1号可溶性蛋白质含量下降（0.06%）最少；从整体来看，谱星1号，中山2号和中山6号现蕾前后可溶性糖含量无明显变化，其他品种现蕾前后明显变化。中山3号在现蕾前10d就达到顶峰，其他品种现蕾时达到最大值。

图5 不同甜菊品种可溶性蛋白含量变化Figure 5.The dynamic changes of soluble protein content in different Stevia materials

2.2 甜菊糖苷含量跃变期糖苷含量变化规律分析

甜菊糖苷含量是评价甜菊品种品质的重要指标之一，不同甜菊品种间糖苷含量存在明显的差异，因此其品质亦有显著差异。

根据上面的方法，我们选择11个甜菊品种进行测量甜菊糖苷和莱鲍迪苷A含量，这里的糖苷含量是甜菊糖苷和莱鲍迪苷A含量之和，11份样品中甜菊糖苷总含量为7%～11%。结果如图6可以看出，除了中山1号、中山4号和中山6号现蕾期变化差异性不显著，其他品种在现蕾期前后变化差异性显著，下降最多的是江甜1号（3.89%），下降最少的是中山5号（0.22%）；从整体来看，江甜1号、守甜3号和中山6号糖苷总含量最高，江甜2号、中山1号、中山3号和中山4号糖苷总含量较低。谱星1号和中山3号在现蕾前5d达到最大值，其他9个品种在现蕾时达到顶峰。

图6 不同甜菊品种糖苷含量变化Figure 6.The dynamic changes of glycosides in different Stevia materials

2.3 甜菊糖苷含量及产量与理化特性相关分析

如图7，11个甜菊品种在初蕾期，中山6号和守田3号的糖苷含量最高，江甜1号、谱星1号、江甜3号、中山5号和中山2号糖苷含量较高，中山3号、江甜2号和中山4号糖苷较低，中山1号糖苷含量最低。按糖苷含量高低顺序，产量、SOD活力和POD活力呈多峰曲线，各品种间差异明显，多酚含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量曲线呈直线趋势，各品种间无明显差异性。如图8，11个甜菊品种中，谱星1号从初蕾期到始花期糖苷含量下降最多，在初蕾期其糖苷含量比江甜3号和中山5号多，在始花期低于江甜3号和中山5号，其他与初蕾期保持一致。

图7 11个甜菊品种初蕾期糖苷含量高低顺序及生理指标变化Figure7.The stevioside content sequence and physiological changes of 11 Stevia varieties in early bud

图8 11个甜菊品种始花期糖苷含量高低顺序及生理指标变化Figure 8.The stevioside content sequence and physiological changes of 11 Stevia varieties in early flowering

3 讨论

在正常情况下，植物的叶绿体和线粒体在电子传递过程中会产生活性氧，在POD、SOD的共同作用下，可以清除氧的自由基，减少自由基对膜的损伤，使活性氧处于产生和清除的动态平衡[9，18]。李强栋等认为生殖生长阶段嫩叶适宜选用POD分析[19]。本文研究结果，POD、SOD酶活力在现蕾前保持稳定，现蕾后稍有下降，这与廖春丽[21]等对大蒜和徐小万[21]等人对辣椒研究结果一致。

可溶性糖和蛋白质是一项质量和资源评价的重要指标，甜叶菊在花蕾期可溶性糖和蛋白质达到最高，何开跃等人[22-23]研究矮牵牛和高山杜鹃的蕾期可溶性糖含量高于花期。本文研究结果，可溶性糖与可溶性蛋白含量在蕾后开始下降，与糖苷呈正相关性。表现在现蕾前1个月里，植株矮小、生长缓慢。现蕾期是生长发育的转折时期，因为地上、地下部分生长量达到一定的基础，并且此时气温升高，植株生长加快，同时植株生长也进入生殖生长，所以此时各理化特性达到顶峰。初花期是营养生长和生殖生长两旺的时期，开始生殖生长强于营养生长，营养分配以供应花为主，叶面积指数达到最大值。

翁伯琦等人[24]研究表明花生花针期、结荚期和饱果期花生叶片中可溶性蛋白质含量变化趋势基本一致。11个甜菊品种在现蕾期前后，其多酚含量、可溶性糖、可溶性蛋白含量与糖苷含量变化趋势一致，这与花生相同。现蕾前后理化特性无明显变化，采摘期可从现蕾前10d开始持续到现蕾后10d。现蕾前明显增加的，采摘期切忌提前，现蕾后理化特性明显下降，采摘期一定要在现蕾时。

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