普拉克索引起大鼠Y迷宫冲动样行为及机制

马文涛，高 翔，宫泽辉，雍 政，苏瑞斌

（军事医学科学院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京100850）

·论著·

普拉克索引起大鼠Y迷宫冲动样行为及机制

马文涛，高 翔，宫泽辉，雍 政，苏瑞斌

（军事医学科学院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京100850）

目的观察普拉克索（PPX）改变大鼠Y迷宫电击逃避任务的行为特点,并探讨其可能的作用机制。方法大鼠一次性sc给予PPX 0.1，1和10 mg·kg-1后，采用Noldus Etho Vision XT8影像行为轨迹分析系统检测大鼠Y迷宫电击逃避任务中判断正确反应次数、穿梭次数、运动距离和安全区停留时间的变化。通过大鼠震惊反射前脉冲抑制实验和清醒大鼠脑微透析实验，观察PPX对正常大鼠感觉运动门控系统以及对纹状体、杏仁核内单胺类神经递质含量的影响。结果与正常对照组对比，PPX组大鼠在Y迷宫判断正确反应次数上无显著性差异，但在一次逃避任务完成后、下一个任务开始前，迷宫内继续穿梭次数和运动距离显著增加（P＜0.01），安全区停留时间明显减少（P＜0.05），表现出类似强迫冲动的行为。震惊反射实验中，PPX组大鼠出现了前脉冲抑制受损的现象（P＜0.01）。脑微透析结果显示，PPX对纹状体和杏仁核内多巴胺和5-羟色胺（5-HT）的浓度无明显影响。结论PPX可能通过损害感觉门控系统而诱导大鼠表现出类似强迫-冲动的行为。

普拉克索；强迫行为；Y迷宫；感觉运动门控

普拉克索（pramipexole，PPX）是一种非麦角类多巴胺D3受体偏爱性激动剂，于1997年美国FDA批准该药用于帕金森病的治疗。临床不良反应监测发现，PPX的副作用主要以神经系统和消化系统为主，其中神经系统不良反应主要表现为头晕、头昏、嗜睡和幻觉等［1］。近年来，国内外陆续报道，PPX可诱发帕金森病患者出现强迫和冲动异常行为，如强迫购物［2］和病理性赌博［3-4］等。近期报道，在反-不劳而获行为（contra-free loading）［5］、概率折扣任务［6］以及模拟赌博行为［7］等强迫冲动行为动物模型上对PPX进行评价，均提示PPX与强迫冲动行为的发生相关，但其发生机制尚不明确。有些研究者认为，其作用机制与腹侧纹状体活性减弱［8-9］及多巴胺转运体功能低下有关［10］；有的学者则提出与感觉运动门控（sensorimotorgating，SG）受损有关［11］；另外单胺类神经递质，尤其是多巴胺含量的改变也可能密切参与其中。

SG是中枢神经系统的一种过滤和筛选信息的能力，以防止信息过载，保证思维的连贯性，其意义在于对前脉冲刺激信号早期知觉编码的保护，减少后出现的震惊刺激对前脉冲刺激的干扰［11-12］。许多精神疾病行为异常都被证实与SG功能失调和前脉冲抑制（prepulse inhibition，PPI）缺失密切相关，如精神分裂症、强迫症、躁狂性抑郁症、成年自闭症及其他与皮质-纹状体-丘脑环路紊乱相关的精神疾病［13］。在PPX导致的行为异常与SG缺失的相关性研究中，众多结果也存在分歧［14-16］。为此，本研究将采用Noldus Etho Vision XT8影像行为轨迹分析系统，采用新的参数分析前期观察到的PPX引起大鼠Y迷宫电击逃避任务异常行为；然后分别利用大鼠听觉震惊反射PPI实验和清醒大鼠脑微透析实验，观察大鼠SG系统以及纹状体、杏仁核内单胺类神经递质释放含量的变化，以试图揭示大鼠行为改变与SG及神经递质之间的关系。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

PPX（北京世联恒通化学技术有限公司，批号20120825）；生理盐水（石家庄四药有限公司，生产批号：120729401）；复方氯化钠注射液（山东齐鲁制药有限公司，生产批号：3E13120407）。

Y迷宫（张家港市生物仪器厂）；Etho Vision XT8影像行为轨迹分析系统（荷兰Noldus公司）；MED-ASR-PR01震惊反射测试系统（美国MED Associates公司）；安捷伦1100系列液相色谱工作站（美国Agilent公司）；INTRO电化学检测器（荷兰Antec Leyden公司）；微透析探针（MD-2204，4 mm和MD-2200，2 mm）和M2251型脑内引导管（美国BAS公司）；CMA120清醒动物装置和CMA/100微量注射泵（瑞典CMA公司）；ODS-C18色谱柱（10μm，250 mm×4.6 mm）（美国Waters公司）；大鼠脑立体定位仪（美国Stoelting公司）；STRONG90高速手术钻（韩国SAESHIN公司）；DT-100型分析天平（北京光学仪器厂）。

1.2 动物

SD大鼠，雄性，体质量180～220 g，SPF级，斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK（京）2011-0004。动物室按自然昼夜节律采光，自由进食和饮水。

1.3 Y迷宫实验

1.3.1 训练筛选

刺激电压50～70 V，延时3 s。训练时根据大鼠个体差异，使大鼠快速逃避电刺激的同时，选择尽量低的电压强度以减少过度刺激。大鼠放入Y型迷宫适应3 min后，安全臂以无规则次序变换；大鼠逃入安全区后，灯光继续作用15 s，大鼠所在臂作为下一次测试的起点；2次测试之间不熄灯、无休息，依次重复，每天训练30次。以连续20次测试中≥17次正确反应（行为正确率＞85%）为达标。

1.3.2 分组测试

将训练达标大鼠随机分为正常对照、PPX 0.1，1和10 mg·kg-1组，sc给药15 min后进行测试。以随机序列切换安全区域，时间间隔固定为15 s，用摄像机录制整个Y迷宫实验行为，采用Noldus Etho Vision XT8软件进行分析。统计20次逃避任务中大鼠判断正确次数、进入中心区总频次、Y迷宫内移动总距离以及在安全区停留总时间进行分析。大鼠在安全区提示灯光亮起后，首次选择并进入安全区记为正确逃避反应。以大鼠前爪踏入及接下来的后爪踏出中心区域记为1次穿梭行为。

1.4 听觉震惊反射前脉冲抑制实验

听觉震惊反射实验在内部装有扩音器的隔音箱中进行，大鼠通过固定笼连接在重力感应器上。大鼠在固定笼不可自由活动，当听到扩音器放出的声音惊吓刺激时形成听觉震惊反射，受到惊吓的程度刺激由重力感应器感应，并通过Startle Reflex 5软件系统进行分析。

背景噪音类型为白噪声，强度为65 dB，全程打开。根据前期预实验的结果，震惊刺激设置为110 dB白噪声，前脉冲刺激设置为83 dB白噪声，以进行下一步实验。32只正常大鼠随机分为正常对照、PPX 0.1，1和10 mg·kg-1组，sc给药10 min后放入固定笼，适应5 min后开始实验。实验分为BlockⅠ，BlockⅡ和BlockⅢ3个阶段。BlockⅠ为10个序列，震惊刺激设置为白噪声，110 dB，持续时间20 ms，序列之间的间隔在10～20 s之间随机变化，均无前脉冲刺激。BlockⅡ设置为50个序列；每个序列之间的间隔在10～20 s之间随机变化。BlockⅡ中的刺激类型分为5种，区别为前脉冲刺激/震惊刺激间隔延迟设置为0，30，60，90和120 ms。每种刺激类型在50次序列中出现10次，出现顺序随机。前脉冲刺激设置为白噪声，83 dB，持续时间10 ms。震惊刺激设置为白噪声，105 dB，刺激持续时间20 ms。间隔为0 ms时，只有前脉冲刺激而无震惊刺激。BlockⅢ同BlockⅠ。

1.5 清醒大鼠脑微透析实验

1.5.1 脑微透析手术

40只正常大鼠分批称重，水合氯醛（400 mg·kg-1）麻醉，俯卧固定于立体定位仪上，调整使颅骨面水平；剪开颅骨上皮肤和皮下组织，用3%H2O2浸湿的棉签烧灼止血并充分暴露颅骨表面，定位相关脑区位置，牙科钻开孔，并垂直置入探针底座。纹状体：前囟前0.6 mm，前囟侧±2.5 mm，颅骨面下3 mm（4 mm探针，实际探针将下插7 mm）；杏仁核：前囟前2.5 mm，前囟侧±4.2mm，颅骨面下7.4 mm（2 mm探针，实际探针将下插9.4 mm）。在定位附近颅骨表面固定2个小螺钉，并以牙科水泥使底座固定于颅骨面；手术完毕，待水泥凝固后取下大鼠，每只im注射青霉素80 kU。术后单笼饲养，恢复48～72 h后进行透析。

1.5.2 脑透析液中神经递质含量的测定

微透析实验之前，首先将微透析探针通过MF-5366型连接管与微量注射泵相连，微量注射泵以1.5μL·min-1的流速灌流人工脑脊液（以复方氯化钠注射液替代）。随后用乙醚将术后恢复后的大鼠轻微麻醉，放入微透析装置，置入探针，平衡1 h后开始收集，每20 min采集一个样品，随即HPLC进样检测。大鼠随机分为正常对照、PPX 0.1，1和10 mg·kg-1组，每只大鼠采样测定3个基础释放值后，皮下注射药物并继续收集透析样品至200 min。透析结束后，取出探针用水冲洗30 min可重复使用2～3次。实验结束后处死大鼠，取全脑做切片检查，舍弃位置不正确大鼠的数据。

1.5.3 色谱条件

流动相配制：磷酸二氢钠15.59 g，辛烷磺酸钠0.1605 g，EDTA 0.0080 g，氯化钾0.1493 g，溶于800 mL双蒸水中，加入乙腈10 mL，乙酸5 mL，甲醇150 mL，浓磷酸调pH至3.32，双蒸水定容至1000 mL，0.22μm微孔滤膜抽滤，超声25 min脱气。电化学检测器的工作电极为玻璃碳，参比电极为固态的Ag/AgCl，检测工作电压为+0.52 V，流速为0.2 mL·min-1，柱温33°C。透析前2 h打开检测器，待基线平稳后进样分析。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 普拉克索对大鼠Y迷宫行为的影响

图1显示，与正常对照组对比，PPX组大鼠Y迷宫正确反应次数无显著性差异（图1A）；PPX 0.1～10 mg·kg-1迷宫内穿梭次数显著增加（图1B，P＜0.01），PPX 10 mg·kg-1组运动距离显著增加（图1C，P＜0.01），PPX 10 mg·kg-1组安全区停留时间明显减少（图1D，P＜0.05）。

2.2 普拉克索对大鼠震惊反射幅度和PPI的影响

如图2A所示，与正常对照组对比，PPX在间隔60 ms时可增加前脉冲刺激存在条件下的震惊反射幅度（P＜0.05，P＜0.01）。图2B结果显示，PPX在间隔60 ms时可拮抗PPI现象（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 普拉克索对大鼠纹状体和杏仁核内神经递质释放的影响

如图3所示，与正常对照组相比，PPX对大鼠纹状体内多巴胺、5-羟色胺（5-hydroxytraptamine，5-HT）及其代谢产物5-羟吲哚乙酸的浓度无明显影响；可显著降低多巴胺的代谢产物高香草酸的含量（P＜0.01）。

PPX对杏仁核细胞外液多巴胺及其代谢产物的浓度无明显影响，对5-HT及其代谢产物亦无显著影响（结果略）。

Fig.1 Effect of pramipexole（PPX）on right reaction number（A），shuttle number of times（B），distance traveled in maze（C）and time in safe area（D）of SD rats.The rats were adminstered with sc PPX 15 min before behavior test.n=4.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normalcontrolgroup.

Fig.2 Effect of PPX on startle amplitude（A）and prepulse inhibition（PPI，B）in SD rats.The rats were treated with subcu⁃taneous injection of PPX 10 min before behavior test.，compared with normalcontrolgroup.

Fig.3 Effect of PPX on dialyzed content of dopamine（A），5-hydroxytryptamine（5-HT）（B），5-hydroxyindole-3-acetic acid（5-HIAA）（C）and homovanilic acid（HVA）（D）in striatum of SD rats.After 3 background points were obtained，the rats were injected with PPX.The average value of the 3 background points was regarded as 100%.**P＜0.01，compared with normalcontrolgroup.

3 讨论

本研究结果表明，PPX在不影响大鼠Y迷宫选择正确率的情况下，表现出类似冲动强迫的行为，同时大鼠出现了一定程度的PPI缺失，提示SG系统受损；进一步机制研究表明，PPX可使大鼠纹状体多巴胺和5-HT出现升高趋势，但并无统计学意义，这是否是PPX导致行为异常的原因之一尚不明确。

电刺激Y迷宫结果显示，经过训练的大鼠PPX单次给药后，不影响其首次选择安全臂的正确率，但不同于正常对照组进入安全区后等待下一次逃避任务，PPX组大鼠表现为提前、过度地在迷宫内穿梭逃避的行为。结合文献调研分析认为，该行为是一种类似强迫冲动的行为。有文献报道，在强迫行为动物模型反不劳而获行为中，在不用踏杆即可获取水的情况下，PPX显著增加了大鼠的踏杆次数［5］。在一些冲动行为模型中，如概率折扣任务［6］以及模拟赌博行为［7］中，PPX也导致了冲动行为的产生。这与临床上越来越多的PPX导致强迫行为以及冲动控制障碍的不良反应报道相一致。因此，本研究选取了新的测试参数进行评价。结果表明，PPX可剂量依赖性地增加大鼠强迫冲动行为。Y迷宫内安全区穿梭次数，作为本研究选取的异常行为的核心参数，与目前比较公认的冲动模型——五项选择的连续反应时间任务中的核心参数提前鼻触行为（早熟行为）存在一定的相似性。这也提示，PPX致大鼠Y迷宫异常行为作为强迫冲动动物模型的潜在可能性。

有证据提示，强迫行为往往伴有SG功能受损［11，17-19］。SG功能受损会引起一系列认知障碍、精神紊乱，其中与精神分裂症尤为密切相关［20-22］。而高冲动性在临床上也表现为注意缺陷性多动症、药物滥用和精神分裂。因此，本研究选取了听觉震惊反射实验这一目前公认的SG模型，观察了PPX是否损害了SG功能，从而导致强迫冲动行为。前期已有PPX对PPI影响的相关研究［14-16］，但结果并不一致。本研究结果表明，PPX对大鼠SG功能产生了一定程度的损伤。

强迫冲动行为是多因素导致的精神行为紊乱，SG为其中一个方面［23］，神经递质的异常释放可能是该异常行为产生的的重要神经生物学机制，尤其与多巴胺、5-HT和去甲肾上腺素的释放密切相关［24］。纹状体是调节SG系统环路的重要一环，腹侧纹状体和背侧纹状体分别在认知冲动和运动冲动行为中发挥重要作用；杏仁核是产生、识别和调节情绪的核团，与纹状体和丘脑都有密切的双向投射，也参与到PPI的调节中［13］。基于此，本研究利用清醒大鼠脑微透析方法检测了PPX对大鼠神经递质释放的影响。结果显示，PPX对大鼠纹状体内多巴胺、5-HT及其代谢产物5-羟吲哚乙酸的浓度有一定的升高趋势，但并无统计学差异；而对多巴胺的代谢产物高香草酸的含量有显著的降低作用，推测PPX可能通过直接激活多巴胺受体和间接调节神经递质的含量，作用于PPI相关的以及冲动-强迫相关的纹状体等脑区，使得SG功能受损，诱使机体出现了冲动-强迫样异常行为。但该推测尚在进一步实验验证。

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Impulsive-like behaviors ofrats in Y-maze task induced by pramipexole and its mechanism

MA Wen-tao，GAO Xiang，GONG Ze-hui，YONG Zheng，SU Rui-bin
（State Key Laboratory of Toxicology and MedicalCountermeasures，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military MedicalSciences，Beijing 100850，China）

OBJECTIVE To analyze impulsive-like behaviors of SD rats induced by pramipexole in Y-maze avoidance tasks.METHODS Behaviors of SD rats in Y-maze avoidance tasks were recorded with a camera and analyzed by Noldus Etho Vision XT8 software after acute subcutaneous injection of pramipexole（0.1，1 and 10 mg·kg-1），including right reaction numbers of 20 consecutive avoidance tasks，shuttle number oftimes between the three arms of Y-maze，distance covered in Y-maze and time spentin safe arms during 20 consecutive avoidance tasks.Then，the prepulse inhibition（PPI）of the startle reflex test was used to assess the effect of pramipexole on sensorimotor gating（SG）.Effects ofpramipexole on the dialyzed contentofmonoamine neurotransmitter and its metabolites in the striatum and amygdala of SD rats were measured by microdialysis in vivo.RESULTS Compared with normal control group，the rats of pramipexole group showed a significant increase in the shuttle number of times and distance covered in Y-maze between Y-maze avoidance tasks（P＜0.01），but a statistically significantdecrease in the time spentin safe arms（P＜0.01），while the number ofrightreactions in Y-maze avoidance tasks was not changed.Such premature responses were quite similar to certain impulsive-compulsive behaviors in rodentmodels，such as five-choice serialreaction time tasks.In the PPI test，pramipexole displayed an impairing effect on SG（P＜0.01）.The microdialysis results showed that there was an increase of dopamine and 5-hydroxytryptamine in the striatum of pramipexole group，but not statistically significant.Monoamine neurotransmitters and their metabolites were not significantly changed in the amygdala.CONCLUSION Pramipexole can induce impulsive-compulsive behaviors in Y-maze avoidance tasks，which mightbe attributed to impaired SG.

pramipexole；compulsive behavior；Y-maze；sensorimotor gating

The projectsupported by NationalScience and Technology Major Projectof China（2012ZX09301003-001）

SU Rui-bin，E-mail：ruibinsu@126.com，Tel：（010）66931607；YONG Zheng，E-mail：yongzhabc@ 126.com，Tel：（010）66931621

R971

A

1000-3002-（2016）05-0491-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.002

2015-12-08接受日期：2016-04-15）

（本文编辑：乔 虹）

国家科技重大专项（2012ZX09301003-001）

马文涛，男，硕士研究生，Tel：（010）66931621，

E-mail：jsmawentao@163.com

苏瑞斌，E-mail：ruibinsu@126.com，Tel：（010）66931607；雍政，E-mail：yongzhabc@126.com，Tel：（010）66931621