亚慢性铝暴露对Wistar大鼠学习记忆及海马CA1区c-Fos表达的影响

张立丰，白春玉，张 迪，赵丽妮

（沈阳医学院1.公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健学教研室，2.基础医学院药理学教研室，辽宁沈阳110034）

亚慢性铝暴露对Wistar大鼠学习记忆及海马CA1区c-Fos表达的影响

张立丰1，白春玉1，张 迪1，赵丽妮2

（沈阳医学院1.公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健学教研室，2.基础医学院药理学教研室，辽宁沈阳110034）

目的探讨亚慢性铝暴露对大鼠学习记忆能力和c-Fos表达的影响，探索铝对大鼠认知功能损害的毒性作用及机制。方法Wistar子代大鼠自出生之日起，分别通过乳汁或饮水染毒AlCl32.0，4.0和8.0 g·L-1连续3个月。Morris水迷宫法检测子代大鼠的学习记忆能力，石墨炉原子吸收光谱法检测子代大鼠海马铝含量，HE染色观察海马CA1区神经细胞形态，RT-PCR法检测子代大鼠海马CA1区c-fos基因表达，免疫组化法检测CA1区c-Fos蛋白表达。结果染AlCl3组子代大鼠学习记忆能力明显低于对照组（P＜0.05，P＜0.01），海马的铝含量高于对照组（P＜0.01），其海马CA1区神经细胞呈现神经纤维稀疏、神经元细胞脱失甚至空泡样变性等病理改变；染AlCl34.0和8.0 g·L-1组子代大鼠海马c-fos mRNA表达水平分别低于对照组和染AlCl32.0 g·L-1组（P＜0.01）。染AlCl3组子代大鼠CA1区c-Fos蛋白表达水平低于对照组（P＜0.01）。结论亚慢性铝暴露损害大鼠学习记忆能力的机制可能与AlCl3造成海马CA1区神经细胞病理学改变、功能减弱以及c-Fos表达水平降低有关。

铝；海马；学习记忆；c-Fos

铝在地壳中含量仅次于氧和硅。人们通过铝制炊具和容器、含铝食品添加剂、含铝水处理剂和含铝药物等途径频繁接触铝，其被摄取、吸收并在全身组织器官中分布。铝是一种神经毒物，脑是铝的蓄积部位和主要靶器官，神经细胞对于铝的毒性十分敏感，铝暴露可导致人的认知能力和智力下降，甚至引起神经元死亡［1-2］。由于铝在各领域的广泛应用和对广大居民健康的影响，铝暴露所导致的神经系统损害已成为全球性公共卫生问题［3-4］。铝是智力低下性神经疾病的一个重要环境致病因子。海马是学习记忆的关键脑区，海马区即刻早期基因（immediately early gene，IEG）c-fos及其蛋白表达在学习记忆信号传导中起重要作用，但其在铝的作用下有无变化尚未见报道。本研究考察3个剂量水平的氯化铝（AlCl3）对大鼠学习记忆的损害作用，从大鼠海马CA1区神经细胞病理改变、海马c-fos基因及其蛋白表达方面，初步探索铝对大鼠认知功能损害的毒性作用机制，为深入研究铝的毒性及其防治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物

Wistar大鼠，合格证号：SCXK（辽）2015-0001，由沈阳医学院实验动物中心提供，体质量为250～270 g，雌雄比例2∶1。维持环境温度18～23℃，相对湿度45%～55%，适应环境1周后用于实验。

1.2 主要试剂和仪器

AlCl3（分析纯，国药沈阳化学试剂有限公司），RT-PCR kit（TaKaRa BIO），兔抗大鼠c-F os抗体（美国Santa Cruz公司），山羊抗兔IgG二抗（武汉博士德公司）。原子吸收光谱仪（日本岛津公司），Morris水迷宫（中国医学科学院），9700PCR仪（美国应用生物系统公司），EC250-90电泳仪（美国Thermo公司），凝胶成像分析系统（美国UVP公司），显微图像分析系统（日本Olympus公司）。

1.3 动物分组和染毒

随机将Wistar雌性大鼠40只，分为对照组、AlCl32.0，4.0和8.0 g·L-1组，雌∶雄=2∶1同笼进行交配，次日晨发现阴栓或阴道分泌物镜检有精子者定为受孕。分娩首日对照组母鼠饮用蒸馏水，AlCl3组母鼠分别饮用含AlCl32.0，4.0和8.0 g·L-1蒸馏水溶液。各AlCl3组子代大鼠在断乳前经由吸吮母乳染铝，断乳后自行饮含AlCl32.0，4.0和8.0 g·L-1的蒸馏水摄入铝；对照组的子代大鼠断乳前吸吮对照组母乳，断乳后自行饮蒸馏水。染毒时限从子代大鼠出生后首日连续3个月，然后进行各项指标测定。

1.4 Morris水迷宫法测定子代大鼠学习记忆能力

学习记忆训练和测试在Morris水迷宫内进行。各组子代大鼠每天训练4次，连续5 d。记录子代大鼠找到水下平台时间，如子代大鼠在60 s内找到平台，可允许其在平台上停留约15 s；如未到达平台，引导其到达平台并停留15 s。训练5 d后，间隔1周将子代大鼠置于同样环境开展定位航行实验，评估子代大鼠逃避潜伏期和路径总长度；空间探索实验，记录其进入目标象限次数和在目标象限停留时间。

1.5 石墨炉原子吸收光谱法测定子代大鼠海马铝含量

准确称取各组子代大鼠海马0.2 g于石英烧杯中，加5～8 mL混合酸（浓硝酸∶高氯酸=4∶1，V/V），同时做空白对照。低温加热至试样全部溶解，继续加热蒸发至近干，加2%硝酸溶解残留物并定容至50 mL，用石墨炉原子吸收光谱法测定铝含量，结果表示为每克湿重样本铝的含量。

1.6 HE染色法观察海马神经细胞形态

将各组子代大鼠脑组织进行石蜡包埋，冠状切片（厚度为20μm），每3张取1张，37℃条件下HE染色，中性树胶封片，显微照相系统摄片，观察各组海马神经细胞形态。

1.7 RT-PCR法测定子代大鼠海马c-fos mRNA表达水平

取各组子代大鼠海马制成匀浆，Trizol一步法提取总RNA，进行定量与RNA纯度鉴定。用TaKaRa RT-PCR试剂盒（AMV）Ver.2.1的二步法进行PCR。内参β肌动蛋白引物序列：上游5′-TTC⁃CAGCAGATGTGGATCAG-3′，下游5′-AGAGAAGTGGGGTGGCTTTT-3′，PCR产物长度：406 bp。c-fos引物序列：上游5′-CCTCGAGGGGTTCCCGTAGA-3′，下游5′-ACAGACGTGGATATAGCGA-3′，PCR产物长度：497 bp。采用2-ΔΔCt法计算c-fos mRNA相对表达水平。

1.8 免疫组化法测定子代大鼠海马CA1区c-Fos蛋白表达

脑切片脱蜡，脱水，灭活内源性酶，修复抗原，山羊血清封闭，常规ABC法对子代大鼠脑组织进行免疫组化染色。加兔抗大鼠c-Fos单克隆抗体（一抗）（1∶200），漂洗后加山羊抗兔IgG（二抗），DAB显色，中性树胶封片并观察。阴性对照用PBS代替一抗。光镜（×400）下观察。在相同放大倍数下，每张切片取3个不同的视野采集图像，经过Meta Morph，version 4.65显微图像分析系统进行半定量分析。用平均积分吸光度值（average integrated absorbance，AIA）表示海马CA1区c-Fos蛋白表达水平。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 铝暴露对子代大鼠空间学习记忆能力的影响

表1结果显示，定位航行实验中，染铝子代大鼠的平均逃避潜伏期长于对照组（P＜0.05，P＜0.01），随剂量增加而延长，具有剂量相关性（r=0.994，P=0.006）。染铝子代大鼠的游泳距离长于对照组（P＜0.01），随剂量增加而增加，具有剂量相关性（r= 0.971，P=0.029）。空间探索实验中，染铝子代大鼠的停留时间低于对照组（P＜0.01），随剂量增加而缩短（r=-0.962，P=0.038）。染铝子代大鼠的穿越次数低于对照组（P＜0.01），随剂量增加而减少（r=-0.920，P=0.080）。

Tab.1 Effect of AlCl3on spatiallearning and memory of offspring rats in Morris water maze

2.2 铝暴露对子代大鼠海马铝含量的影响

各组染铝子代大鼠海马的铝含量高于对照组（P＜0.01），随剂量增加呈升高趋势，具有剂量相关性（r=0.987，P=0.013）（表2）。

Tab.2Totalaluminumlevelinhippocampusof offspringratsexposedtoAlCl3

2.3 铝暴露对子代大鼠海马CA1区神经细胞形态的影响

对照组神经纤维排列整齐，神经细胞清晰，染色较深，数目多，呈多层。铝暴露各组随染铝剂量增加呈现受损样改变。神经纤维稀疏，间隙较大。神经元细胞层次少而不清，细胞排列稀疏，染色逐渐减弱，数目减少（图1）。

Fig.1EffectofAlCl3onhippocampusnervecellsin CA1areaofoffspringrats（HEstaining）.SeeTab.1for drugtreatment.Thearrowsshowrepresentativehippocampal nervecells.

2.4 铝暴露对子代大鼠海马c-fosmRNA表达水平的影响

AlCl34.0和8.0g·L-1组c-fosmRNA表达水平均低于对照组（P＜0.01），随剂量增加而降低，具有剂量相关性（r=-0.979，P=0.021）。

2.5 铝暴露对子代大鼠海马CA1区c-Fos蛋白表达水平的影响

各染毒剂量组c-Fos蛋白表达水平低于对照组（P＜0.01），随剂量增加而降低，具有剂量相关性（r=-0.943，P=0.057）（表3，图2）。

Tab.3EffectofAlCl3onexpressionofc-fosmRNA andc-FosproteininCA1areaofhippocampusof offspringratsbyRT-PCRandimmunohistochemical analysis，respectively

Fig.2EffectofAlCl3onexpressionofc-Fosproteinin CA1areaofoffspringrathippocampusbyimmuno⁃histochemicalanalysis.SeeTab.1fordrugtreatment.The arrowsshowrepresentativehippocampalnervecells.

3 讨论

本研究发现，随AlCl3染毒剂量增加，子代大鼠学习记忆能力受铝损害加重，有剂量-效应关系。相关研究也证实，染铝子代大鼠表现为学习记忆等认知功能障碍［5］。本研究观察到染铝子代大鼠的海马铝浓度增高，说明在此染铝剂量下，铝能穿越血脑屏障进入子鼠脑内并发生蓄积，这与相关报道一致［6-7］。本研究中子代大鼠生后3个月经消化道染铝直接导致其体内铝蓄积，与暴露剂量呈正相关，说明两者之间存在因果联系。推测铝在脑内逐渐蓄积，进而对中枢神经系统造成损害，铝的神经毒性与铝在海马内的蓄积性有关。

突触可塑性指突触效能的改变，其效能的改变通常与突触结构的修饰有关［8］。微妙的突触结构变化能大大改变突触的生物特性［9］。本研究显示，染铝大鼠海马呈现神经纤维稀疏、神经元细胞脱失甚至空泡样变性等特征性改变，随着染铝剂量增加而损伤明显。此结果表明，染铝造成海马CA1区神经细胞结构受损，或这些损伤弱化突触活性或效能，可能是铝降低大鼠学习记忆能力的部分原因［10］。

海马是学习记忆相关的重要脑区，其中CA1区与学习记忆关系最为密切。IEG能被第二信使诱导，具有把短时程作用的细胞外信号和细胞功能的长时程改变偶联起来的功能。c-fos基因是典型的IEG，其编码的Fos蛋白参与了中枢神经系统内基因表达调控［11］。Fos蛋白作为核内第三信使，通过激活异源二聚体复合物而激活后继靶基因，较长时间地改变神经元的结构和功能，完成从第二信使到晚期基因表达的信号转导。本研究观察到染铝子代大鼠海马c-fos mRNA和CA1区c-Fos蛋白表达水平明显降低，且与剂量具有一定的负向剂量-效应关系。揭示亚慢性铝暴露造成海马c-fos基因和其蛋白表达水平降低，激活后继基因能力下降，进而导致大鼠学习记忆能力受损。

IEG表达是在细胞内突触水平涉及长时记忆巩固的事件之一，在突触可塑性修饰和记忆巩固过程中起重要作用。c-F os具有使神经元转录和翻译长时记忆相关蛋白的能力。据报道，ERK能通过pCREB上调c-Fos蛋白表达，并且激活ERK/ MAPK-CREB级联反应，包括ERK/MSK1信号转导通路［12-13］。因此，本研究中大鼠学习记忆能力低下与c-F os表达降低具有相关性，推测铝可能影响上述c-F os相关的信号通路和关键分子。在未来工作中，需要从更深层次上进一步研究证实。

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Effectofsubchronic aluminum exposure on learning and memory and c-Fos expression in CA1 area of hippocampus in Wistar rats

ZHANG Li-feng1，BAIChun-yu1，ZHANG Di1，ZHAO Li-ni2
（1.Department of Child and Adolescent Health and MaternalCare，Schoolof Public Health，2.Department of Pharmacology，Schoolof Basic MedicalSciences，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China）

OBJECTIVE To study the effectof subchronic exposure to aluminum（Al）on learning，memory，and immediate early gene expression in rats，and to explore the toxic mechanism of Al on cognitive impairment of rats.METHODS Wistar offspring rats were administered with 2.0，4.0 and 8.0 g·L-1AlCl3in milk and drinking water in sequence from the postnatalday 1 to 3 months.Then，learning and memory of offspring rats were measured by Morris water maze,the hippocampal Alconcentration was quantitated by the atomic absorption spectrophotometer,the CA1 area of the hippocampus was collected for HE observation,and the c-fos gene and c-Fos protein expression in CA1 area ofthe hippo⁃campus in offspring rats were detected by RT-PCR and immunohistochemistry.RESULTS Learning and memory of offspring rats in AlCl3groups were significantly lower than those in control group（P＜0.01，P＜0.05）.The hippocampal Al concentrations of offspring rats in AlCl3groups were higher than those in controlgroup（P＜0.01）.The morphology in CA1 area of offspring rats′hippocampus in AlCl3groups exhibited sparse nerve fibers,depigmentation and even vacuolar degeneration in neurons and other pathologicalchanges after Altreatment；c-fos mRNA expression in the hippocampus in 4.0 and 8.0 g·L-1AlCl3group rats was significantly lower than in control and 2.0 g·L-1AlCl3group，respectively（P＜0.01）.c-Fos protein expression in offspring rats′hippocampus in AlCl3exposed groups was significantly lower compared with controlgroup（P＜0.01）.CONCLUSION Alcan injure learning and memory ofrats，which is related to hippocampalneuronaldysfunction in CA1 area induced by pathological changes，low levels of c-fos gene and c-Fos protein expression subsequently.

aluminum；hippocampus；learning and memory；c-Fos

The project supported by Science and Technology Research Project of Education Bureau in Liaoning Province（L2015544）；and Science and Technology Fund of Shenyang MedicalCollege（20153043）

ZHANG Li-feng，E-mail：zgykdxzlf@163.com

R995

A

1000-3002-（2016）05-0553-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.011

2016-01-19接受日期：2016-03-18）

（本文编辑：沈海南）

辽宁省教育厅科学技术研究项目（L2015544）；沈阳医学院科技基金（20153043）

张立丰，男，副教授，医学博士，主要从事金属毒理和神经毒理及儿童少年与妇幼卫生保健研究。

张立丰，E-mail：zgykdxzlf@163.com