HPLC法测定牛黄解毒片中蒽醌类化合物的含量

刁全平，侯冬岩，郭华，回瑞华

(鞍山师范学院 化学与生命科学学院,辽宁 鞍山 114007)



HPLC法测定牛黄解毒片中蒽醌类化合物的含量

刁全平，侯冬岩，郭华，回瑞华

(鞍山师范学院 化学与生命科学学院,辽宁 鞍山 114007)

建立同时测定牛黄解毒片中大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚4种蒽醌类化合物含量的方法.用20% H2SO4水解样品，以丙酮为溶剂，索氏提取样品中的蒽醌类化合物，流动相为甲醇-0.5%磷酸水溶液(75∶25，V/V)，色谱柱为 Kromasil C18柱，流速为1.0 mL/min，检测波长为230 nm，高效液相色谱法测定4种蒽醌类化合物的含量.样品中4种蒽醌类化合物分别在1.50～150，0.950～95.0，1.30～130，1.15～115 mg/L范围内呈良好的线形关系，测定的重复性较好，并在24 h内稳定，4种化合物加标回收率均在98.14%～101.3%之间，测定结果准确.该方法操作便捷，准确，灵敏度高，稳定性好，可用于牛黄解毒片的药物质量控制.

牛黄解毒片；蒽醌类化合物；HPLC

牛黄解毒片是由人工牛黄、雄黄、石膏、大黄、黄芩、桔梗、冰片、甘草八味中药配制而成的一种中成药，具有清热解毒的功效[1]，主要用于治疗火热内盛、咽喉肿痛、牙龈肿痛、口舌生疮、目赤肿痛等病症.蒽醌类化合物具有较强的泻下、消炎、抗菌作用[2～3]，是牛黄解毒片的主要功效成分，其含量的测定主要为HPLC法[4～6].牛黄解毒片由八味中药组成，成份复杂，在其产品质量的控制上有一定的难度.为了更好地控制该制剂质量，笔者通过对样品中蒽醌类化合物的提取、分离、测定方法的考查，建立了牛黄解毒片中大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等4种蒽醌类化合物含量的测定方法，也为牛黄解毒片中药配伍学的研究提供一定的支持.

1 仪器与试药

1525型HPLC仪，配2996型二极管阵列检测器(美国Waters公司)，AL-204 电子天平(梅特勒-托利多)，HH-2 型恒温水浴锅(常州国华电器有限公司).

大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品购自中国食品药品检定研究院，均为供含量测定用.甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司)、硫酸、磷酸、丙酮均为分析纯，水为二次蒸馏水.

牛黄解毒片(三金集团湖南三金制药有限公司，批号：140901)购自鞍山某药房.

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Kromasil C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)；流动相：甲醇-0.5%磷酸水溶液(75∶25，V/V)；柱温：30 ℃，流速：1.0 mL/min;检测波长：230 nm;进样量：10 μL.

理论塔板数按照大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚算分别是9 035,8804,6946,4073，对照品溶液和供试品溶液色谱图如图1和图2所示(注：1.大黄酸；2.大黄素；3.大黄酚；4.大黄素甲醚).

图1 对照品色谱图 图2 样品色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精确称取大黄酸(3.0 mg)、大黄素(1.9 mg)、大黄酚(2.6 mg)、大黄素甲醚(2.3 mg)置于10 mL棕色容量瓶中，乙醇溶解并定容，得大黄酸(300 mg/L)、大黄素(190 mg/L)、大黄酚(260 mg/L)、大黄素甲醚(230 mg/L)对照品储备液.

分别移取4种对照品储备液0.1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，乙醇定容，制得大黄酸(3.0 mg/L)、大黄素(1.9 mg/L)、大黄酚(2.6 mg/L)、大黄素甲醚(2.3 mg/L)混合对照品溶液.

2.2.2 供试品溶液的制备 精确称取经剪刀剪碎的样品1.0 g左右，置于100 mL圆底烧瓶中，加入20%的H2SO4水溶液20 mL，沸水浴下水解30 min，用布氏漏斗抽滤除去水解液，滤渣用蒸馏水清洗，滤纸和滤渣在80 ℃下烘干后，以丙酮为溶剂进行索氏提取，60 ℃水浴提取30 min，回流液转移至100 mL容量瓶中，定容后为供试品溶液.

2.3 标准曲线的绘制

将步骤2.2.1制备的对照品储备液分别进行稀释，形成系列梯度浓度溶液，HPLC测定各溶液后，以浓度c(mg/L)为横坐标，峰面积A(AU*S)为纵坐标，绘制标准曲线，如表1所示.

表1 对照品标准曲线

2.4 精密度试验

取步骤2.2.1制备的混合对照品溶液，按“2.1”中色谱条件重复进样测定6次，记录峰面积，计算相对标准偏差，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为1.17%、0.97%、1.04%和1.08%(n=6)，结果表明仪器精密度良好.

2.5 稳定性试验

取步骤2.2.2制备的供试品溶液，按“2.1”中色谱条件，分别于0,2,4,8,24 h进行测定，记录峰面积，计算相对标准偏差，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为1.15%、0.80%、1.04%和0.92%(n=5)，结果表明供试品溶液在24 h内稳定.

2.6 重复性试验

按照步骤2.2.2，制备供试品溶液6份，按“2.1”中色谱条件进行测定，记录峰面积，计算相对标准偏差，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为0.86%、1.00%、0.45%和1.06%(n=6)，说明本方法重复性良好.

2.7 加标回收率试验

精确称取样品约0.5 g3份，分别加入不同质量的4种对照品，按照步骤2.2.2制备供试液，HPLC测定含量，计算各对照品的加标回收率，结果如表2所示.

表2 加标回收率实验

2.8 样品含量测定

取步骤2.2.2制备的供试品溶液，HPLC进行测定，利用标准曲线测定其含量，结果如表3所示.

表3 样品含量测定结果

3 讨论

本文采用20%硫酸对样品进行水解，使结合态的蒽醌类化合物转化为游离态，增加样品测定的准确性.比较了二氯甲烷、无水乙醇、甲醇、丙酮、乙醚等不同的索氏提取溶剂，发现乙醇、甲醇沸点较高，回流需要较高的温度，二氯甲烷、乙醚提取时间长，并且提取不完全，在所考查溶剂中，丙酮的提取效果最为理想，并且在加标回收率试验中证明丙酮提取比较完全，因此选用其作为提取溶剂，并对提取温度和提取时间进行考查，最后确定60 ℃水浴提取30 min.

HPLC进行含量测定，采用甲醇-0.5%磷酸水溶液体系作为流动相，磷酸作为酸剂调节色谱峰的峰形，提高分离度，甲醇作为有机改性剂.甲醇的比例太高，大黄酸峰与杂质峰分离效果不好，若甲醇比例太低，延长分析时间，当甲醇∶0.5%磷酸水溶液=75∶25(V/V)时，4种蒽醌类化合物都能得到较好的分离，最后选择其为流动相.

[1] 郑永军，赵斌，尤进茂.微波消解ICP-AES法测定牛黄解毒片中的微量元素[J].光谱学与光谱分析，2006，26(6)：1155-1157.

[2] 张丹，蒋心惠.反相高效液相色谱法测定大黄药材中游离及结合型蒽醌类衍生物的含量[J].分析化学，2003，31(4)：459-462.

[3] 郭华，侯冬岩，回瑞华，等.光谱法测定芦荟中蒽醌含量的研究[J].鞍山师范学院学报，2004，6(4)：43-46.

[4] 许乾丽，茅向军，宋晓宁，等.HPLC法同时测定六味安消胶囊中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量[J].药物分析杂志，2010，30(10)：1841-1844.

[5] 靳丹虹，梁芳慧，李敬筠，等.微波辅助提取-HPLC测定决明子中的5种蒽醌类化合物[J].分子科学学报，2007，23(6)：429-433.

[6] 李鑫楠，黄毅岚，张丹，等.RP-HPLC测定熊胆降热丸中的5种大黄蒽醌类化合物[J].华西药学杂志，2007，22(6)：697-698.Determination of anthraquinones in Niuhuang Jiedu Tablets by HPLC

(责任编辑：陈 欣)

DIAO Quanping,HOU Dongyan,GUO Hua,HUI Ruihua

(School of Chemistry and Life Science，Anshan Normal University,Anshan Liaoning 114007,China)

To establish the method of determination for Rhein,Emodin,Chrysophanol and Physcion in Niuhuang Jiedu Tablets.Sample was hydrolyzed by 20% H2SO4,and anthraquinones were extracted by soxhlet extraction with acetone as solvent,and were determined by HPLC with methanol-0.5% H3PO4(75∶25,V/V)as mobile phase at the flow of 1.0 mL/min,Kromasil C18as Column,292 nm as the detection wavelength.The linear relationship of Rhein,Emodin,Chrysophanol and Physcion were 1.50～150,0.950～95.0,1.30～130,1.15～115 mg/L.The anthraquinones were separated completely and were steady in 24 h,the recovery of 4 anthraquinones were 98.14%～101.3%.This method is rapid,accurate,sensitive and steady,and can be used for the quality control of Niuhuang Jiedu Tablets.

Niuhuang Jiedu Tablets;anthraquinones;HPLC

2016-06-03

刁全平(1980-)，男，山东潍坊人，鞍山师范学院化学与生命科学学院副教授，硕士.研究方向：天然产物及药物分析.

R917

A

1008-2441(2016)04-0032-03