鸡屎藤抗鸡传染性支气管炎病毒的体外活性初步研究

杜娟，路义鑫，陈景涛

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150069）

鸡屎藤抗鸡传染性支气管炎病毒的体外活性初步研究

杜娟1，2，路义鑫1，陈景涛2

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150069）

现代研究表明鸡屎藤具有镇痛、镇静等作用，对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、肺炎双球菌有抑制作用。本文选用鸡胚成纤维细胞，采用传染性支气管病毒进行侵染，对半数细胞感染量进行测定。实验结果表明鸡屎藤提取液对体外传染性支气管病毒具有一定的抑制作用。

鸡屎藤，鸡传染性支气管炎，鸡胚成纤维细胞

鸡屎藤，又称鸡矢藤，为茜草科鸡屎藤属草本植物，广泛分布于我国的陕西、甘肃、山东、江苏、安徽、湖南、湖北、广东、贵州等地区。鸡屎藤中含有多种糖苷、黄酮、生物碱及挥发油成分，具有镇痛消炎，抗氧化等功效，其新鲜枝叶被用于熬汤、禽畜饲料添补剂及其他食品加工中。目前，关于鸡屎藤抗炎抗病毒等药理活性已有报道，但未见鸡屎藤对肉鸡传染性支气管炎病毒的体外活性研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品鸡屎藤，于2015年9月采自中国科学院广州华南植物园。1kg药材加10倍量水煎1h，减压抽滤。药渣加5倍量水再煎1h抽滤，合并两次滤液减压浓缩至500mL，加95%乙醇至终浓度75%，4℃静置过夜。离心取上清，调pH值至7.2～7.4，120℃高压灭菌20min，4℃保存备用。利巴韦林，购于国药集团荣生制药有限公司，批号20150216。

1.1.2 鸡胚9d SPF鸡胚，购于中国农科院哈尔滨兽医研究所。

1.1.3 标准毒株传染性支气管炎病毒（IBV）标准株Mass41由中国农科院哈尔滨兽医研究所惠赠，本实验室自行传代保存。

1.2 方法

1.2.1 传染性支气管炎病毒的增殖尿囊腔法接种病毒：取出活鸡胚，传染性支气管炎病毒IBV M41标准株按1:10稀释后种毒，每个鸡胚接种0.2mL病毒液。孵育48h后将鸡胚置于4℃过夜处死。次日，取处死的鸡胚，于超净工作台内用碘酒和75%乙醇消毒，用无菌注射器吸取尿囊液并离心10 min、3000rpm，取上清合并后-20℃保存备用。

1.2.2 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备取9d SPF雏鸡于超净工作台中用碘酒和75%乙醇消毒，打开气室后将鸡胚取出置于无菌培养皿中，分离头部，四肢和内脏，剪成1mm3左右小块，用PBS溶液洗3遍后加5～6倍量0.25%胰酶37℃消化15min，加入细胞生长液终止消化并离心5min，1000rpm。弃上清，沉淀部分用PBS洗3次并吹打均匀，细胞计数并调整细胞密度至2×106个/mL，100μL/孔的细胞量滴入96孔板内，37℃、5%CO2培养箱培养备用。

1.2.3 IBV半数细胞感染量测定（TCID50）取IBV尿囊液，10倍等度稀释，加入长满单层CEF的96孔板，测得IBV对CEF的半数细胞感染量（TCID50）为10-5，因此，使用时将IBV尿囊液稀释100倍至终浓度103TCID50。

1.2.4 鸡屎藤提取液对鸡胚成纤维细胞最大安全浓度的测定用细胞维持液分别将鸡屎藤提取液和利巴韦林稀释为16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.50mg/mL及2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08mg/mL。取单层CEF的96孔板弃培养液后分别加入各浓度的鸡屎藤提取液及利巴韦林，每浓度重复6孔，每孔100μL。置于CO2培养箱培养，每24h记录并用MTT法测各孔490nm波长的OD值。

1.2.5 鸡屎藤提取液体外抗IBV试验根据以上实验测出鸡屎藤提取液和利巴韦林的最大安全浓度分别为4.0mg/mL及0.16mg/mL。取长至单层的CEF细胞进行如下分组：A组：预防组，CEF接种IBV前24h分别加入用细胞维持液稀释为4.0、2.0、1.0、0.50、0.25、0.125mg/mL的鸡屎藤提取液，每浓度做6个重复，每孔加100μL。置于CO2培养箱培养24h后每孔加入100μL 103TCID50的病毒液。B组：治疗组，取CEF细胞加入IBV后培养6h，分别加入鸡屎藤提取液4.0、2.0、1.0、0.50、0.25、0.125mg/mL，每个浓度做6个重复，每孔加100μL。C组：鸡屎藤提取液与利巴韦林同时加入组，在CEF细胞中同时加入利巴韦林及细胞维持液稀释为4.0、2.0、1.0、0.50、0.25、0.125mg/mL的鸡屎藤提取液，每个浓度做6个重复，每孔加100μL。以上均设空白对照组（仅细胞维持液）、阴性对照组（细胞维持液和103TCID50病毒液）、阳性对照组（利巴韦林和103TCID50病毒液）、无细胞调零孔（仅加细胞维持液）。所有分组均放在37℃，5%CO2培养箱内培养。24h后记录并用MTT法测490nm波长下OD值。

2 结果

2.1 鸡屎藤提取液对细胞的安全浓度

表1 不同浓度鸡屎藤提取液和利巴韦林对CEF细胞的OD值影响（=±s，n=6）

表1 不同浓度鸡屎藤提取液和利巴韦林对CEF细胞的OD值影响（=±s，n=6）

注：与空白对照组比较，**p＜0.01，*p＜0.05。

由表1可知：鸡屎藤提取液浓度为4.0mg/mL的OD值与空白对照组的OD值无显著性差异，初步确定4.0mg/mL为鸡屎藤提取液最大安全浓度。利巴韦林浓度为0.16mg/mL是与空白对照组无显著性差异，故利巴韦林的最大安全浓度为0.16mg/mL。

2.2 鸡屎藤提取液体外抗IBV试验#P＜0.05。

表2 鸡屎藤提取液体外抗IBV实验各组细胞OD值（=±s，n=6）

表2 鸡屎藤提取液体外抗IBV实验各组细胞OD值（=±s，n=6）

注：与空白对照组相比～～p＜0.01，～p＜0.05；与阴性对照组相比**p＜0.01，*p＜0.05；与阳性对照组相比##p＜0.01，

由表2可知：在预防组，治疗组和同时作用组实验中，鸡屎藤提取液浓度为0.4、0.2、0.1、0.5、0.25、0.125时的OD值均明显高于IBV感染细胞的OD值（p＜0.05），高浓度（4.0 mg/mL）时，抗IBV活性与阳性药利巴韦林活性相当，因此鸡屎藤提取液有明显的抗IBV感染作用；同时，先给鸡屎藤提取液后再感染IBV以及两种同时给药时的OD值要高于IBV感染后再给药的OD值，据此可初步推测鸡屎藤提取液对鸡传染性支气管炎病毒IBV的预防作用更占主导。

3 结论与讨论

鸡屎藤作为我国传统中草药，有镇痛、解毒、消炎等药效作用，临床疗效显著，安全且毒副作用较少。在我国南方部分地区有将鸡屎藤用于禽畜饲料添加剂的传统，而本实验的结果初步验证了鸡屎藤提取液对鸡传染性支气管炎病毒的拮抗预防作用，为鸡屎藤作为禽畜饲料补充剂的开发利用提供实验依据。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．05.013