中药治疗对HIV感染者T细胞表面PD—1和Tim—3表达水平干预的研究

杨玉琪+王红梅+宋娜丽+贺铮铮+孙俊+蔡怡

摘要：目的探讨中药对HIV感染者T细胞表面PD-1和Tim-3表达水平变化的影响。方法用流式细胞分析术分别检测用中药扶正抗毒丸或康爱保生丸治疗和未治疗的HIV感染者治疗前后T细胞亚群计数和T细胞表面PD-1和Tim-3表达。结果经中药扶正抗毒丸或康爱保生丸治疗的HIV感染者外周血CD4+T细胞计数维持在一定水平，T细胞表面PD-1和Tim-3表达下降，PD-1CD4阳性细胞百分比从044%下降到034%；而未治疗的HIV感染者的CD4+T细胞计数下降，平均下降幅度为55cell/μL，T细胞表面PD-1和Tim-3表达上升，PD-1CD4阳性细胞百分比从031%上升到039%，Tim-3CD8阳性细胞百分比从591%上升到673%。结论中药扶正抗毒丸或康爱保生丸治疗HIV感染，一定时间内可以稳定HIV感染者的CD4+T细胞计数，调节CD4+T、CD8+T细胞表面PD-1和Tim-3表达，对延缓病程起到积极作用。

关键词：艾滋病病毒感染；程序性死亡分子1；T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子3；扶正抗毒丸；康爱保生丸

中图分类号：R51291文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）09-0076-03

程序性死亡分子1（Programmed death-1 PD-1）和T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子3（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain molecule-3 Tim-3）是近期发现的T细胞表面的共刺激分子，它们分别与各自的配体PD-L和Galectin-9结合并传递抑制性的第二信号[1-2]。研究表明[3-4]HIV感染者的T细胞表面增强表达PD-1和Tim-3，且其变化特征与疾病进展密切相关。中药能调节免疫进而延缓艾滋病病程进展是否与T细胞表面PD-1和Tim-3水平表达有关？为此，笔者分析了中医药治疗和未治疗的HIV感染者治疗前后外周血T细胞亚群计数和T细胞表面PD-1和Tim-3表达变化，现报道如下。

1资料和方法

11一般资料于2014年3月—2015年11月期间在云南省红河州建水县中医医院和建水县疾控中心诊治的HIV感染者44例。根据其自愿接受中医药治疗是否，分为中药治疗组和自然病程对照组，其中中药治疗组24例，3例为II-B期患者，CD4+T细胞为200-349 cell/μL，21例为II-A期患者，CD4+T细胞为≥350 cell/μL；自然病程对照组20例，4例为II-B期患者，CD4+T细胞为200-349 cell/μL，16例为II-A期患者，CD4+T细胞为≥350 cell/μL；所有HIV感染者临床表现均未出现艾滋病指征性疾病。所有HIV感染者均签定知情同意书，经单位伦理委员会同意。

12诊断标准符合《中国艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》[5]中HIV感染者的相关诊断标准。

13纳入标准符合HIV感染者相关诊断标准，经蛋白印迹法检查确认HIV抗体为阳性，既往无抗HIV感染的药物治疗史。

14治疗方案自然病程对照组：根据患者的意愿，未采取与HIV感染相关治疗，只定期随访。中药治疗组：按照中国中医科学院中医药防治艾滋病研究中心和中华中医药学会艾滋病分会主编的《艾滋病中医药治疗手册》有关规定[6]，对HIV感染者开展免费中医药关怀救治，根据患者病情、症状分别给予口服扶正抗毒丸、康爱保生丸，或两种制剂交替使用治疗，每次3g，每日4次，连续治疗12个月。扶正抗毒丸：滇药制字（Z）20090003A，处方由黄芪、黄精、白术、女贞子等组成，具有益气养阴，滋肾健脾，清热解毒，每1g丸剂相当原生药44g，成人日用剂量为528g生药。康爱保生丸：滇药制字（Z）20090006A，处方由紫花地丁、黄芩、桑白皮、人参等组成，具有解毒清热，活血祛湿，养阴益气，每1g丸剂相当原生药35g，成人日用剂量为420g生药。扶正抗毒丸或康爱保生丸均为云南省中医药治疗艾滋病试点项目用药，由云南省中医中药研究院附属医院提供。

15观察指标定期随访，观察患者的病情及临床症状体征变化，于治疗前后分别检测患者外周血CD4+T细胞计数、CD8+T细胞计数以及CD4+T、CD8+T细胞表面表达PD-1和Tim-3的阳性细胞百分率。

16实验室检查采集EDTA-K2抗凝静脉血，常温下保存和运输，避免极端温度（冷冻或过热），24 h内用美国BD公司FACSCalibur全自动双激光四色流式细胞仪进行检测。采用微量全血法，分别用CD3/CD4/CD8三色荧光抗体、APC-PD-1和APC-Tim-3抗体标记，用CellQuest Pro软件分析CD4+T细胞计数、CD8+T细胞计数以及CD4+T、CD8+T细胞表面表达PD-1和Tim-3的阳性细胞百分率。抗体购自美国BD公司，CD4/CD8/CD3三色荧光克隆抗体，No：39913，APC anti-human Tim-3，No：B173546，APC anti-human CD279（即PD-1），No：B171333。

17统计学方法全部资料均采用SPSS 170统计软件进行分析，计量资料数据以表示，治疗前后数据的比较运用配对样本T检验分析。以P<005为差异有统计学意义。

2结果

21一般情况44例HIV感染者中，男24例，占5455%，女20例，占4545%，男女之比为120∶1；最大年龄64岁，最小年龄24岁，平均年龄42岁；可能感染途径为性传播30例，经静脉吸毒感染7例，输血感染1例，原因不明6例。

22HIV感染者治疗前后CD4+、CD8+T淋巴细胞计数变化见表1。用中药扶正抗毒丸或康爱保生丸治疗12个月的HIV感染者CD4+T细胞计数、CD8+T细胞计数和CD4/CD8比值稳定在一定范围，治疗前后比较无差异（P>005）。而未治疗的HIV感染者CD4+T细胞计数下降，平均下降幅度达55 cell/μL，但与治疗前比较，无明显差异（P>005）。

3讨论

近年共刺激分子在免疫调节中的作用越来越受到广大研究者的重视，其中发挥负调节作用的共刺激分子PD-1和 Tim-3在 HIV 感染中的作用倍受关注。以往研究报道[7-9]，HIV感染者的T细胞表面增强表达PD-1和Tim-3，且其变化特征与疾病进展密切相关，PD-1和Tim-3在HIV特异CD8+和CD4+T细胞上的表达与血浆病毒载量成正相关，与CD4+T细胞计数成负相关。T细胞表面增强表达PD-1和Tim-3主要损伤了HIV特异性的CD8+T 细胞免疫反应。而在抗病毒免疫中，有效而强大的 T 细胞免疫应答是清除病毒的关键，病毒感染的持续和慢性化常常是由于效应和记忆性 T 细胞的功能缺陷所致。在抗HIV感染临床治疗中，如能针对T 细胞表面PD-1和Tim-3表达进行调节，使机体细胞免疫充分发挥抗HIV感染，可一定程度延缓HIV感染病程进展。

本研究结果：经过中药扶正抗毒丸或康爱保生丸治疗12个月的HIV感染者，CD4+T淋巴细胞计数维持在430个cell/μL以上，而未治疗的HIV感染者CD4+T淋巴细胞计数从505个cell/μL下降到450个cell/μL，其下降速度与以往报道一致，提示中药扶正抗毒丸或康爱保生丸对稳定HIV感染者的CD4+T淋巴细胞计数有明显作用。中药治疗的HIV感染者T细胞表面PD-1和Tim-3的表达与治疗前比有所下降，而未治疗的HIV感染者PD-1和Tim-3的表达升高，我们推测中药扶正抗毒丸或康爱保生丸调节机体免疫功能可能与T细胞表面PD-1和Tim-3表达相关。

目前医学界仍不能成功研究出彻底治愈艾滋病的方法，延缓病程进展、降低病死率、提高患者生存质量是当前临床治疗的主要目的。人体免疫系统是一个复杂的网络，任何环节都是相关联的，在HIV感染的情况下，其复杂性更加难以想象。中医药对机体的免疫调节作用可能涉及多层次、多环节、多靶点，本研究结果提示中药扶正抗毒丸或康爱保生丸治疗后，HIV感染者CD8+和CD4+T细胞上PD-1和Tim-3表达水平下降，相应的PD-l/PD-L和Tim-3/Galectin-9这两个信号通路就可能被阻断或部分阻断，HIV特异性CD4+和CD8+T 细胞功能可得到部分提高。这对于恢复HIV感染者免疫功能，控制 HIV 感染者病程进展起到积极作用，值得在临床上进一步观察研究。

参考文献：

[1]史继静，刘朝奇PD-1及其配体PD-L在HIV感染中的作用[J]生命的化学，2010（30）：397-400

[2]赵慧，王亮，马秀敏，等Tim-3及其配体Galectin-9与病毒感染的关系[J]基础医学与临床，2012，32（9）：1095-1098

[3]Day CL，Kaufmann DE，Kiepiela P，etalPD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progressionNature，2006，443（7109）：350-354

[4]Jones RB，Ndhlovu LC，Barbour JD，et alTim-3 expression defines a novel population of dysfunctional T cells with highly elevated frequeneiesin progressive HIV-1 infeetionJ Exp Med，2008，205（12）：2763-2779

[5]中华人民共和国卫生行业标准WS293-2008，艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准

[6]中国中医科学院中医药防治艾滋病研究中心和中华中医药学会艾滋病分会艾滋病中医药治疗手册[M]北京：中医古籍出版社，2014：7-41