异甘草素对PC12细胞缺氧前后LDH和SOD活性的影响

季玮 李长栋 荔志云 孙建军 付亚杰(兰州军区兰州总医院神经外科，甘肃 兰州 730050)

异甘草素对PC12细胞缺氧前后LDH和SOD活性的影响

季玮 李长栋 荔志云*孙建军 付亚杰
(兰州军区兰州总医院神经外科，甘肃 兰州 730050)

目的观察异甘草素对缺氧诱导神经细胞损伤过程中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)的影响。方法采用体外培养PC12细胞；建立细胞缺氧损伤模型。将细胞分为C(对照组)、H(模型组，即单纯缺氧组)、H1 (异甘草素低剂量组)、H2(异甘草素中剂量组)、H3(异甘草素高剂量组)。即H1、H2、H3加入对应浓度的异甘草素后与H一同放入缺氧环境中，培养时间结束后，再进行统一处理。光学显微镜观察PC12细胞形态；测定上清液中LDH、SOD的含量。结果PC12细胞在缺氧后乳酸脱氢酶(LDH)显著升高，超氧化物歧化酶(SOD)明显减低，而经异甘草素(ISL)干预后，细胞上清液中LDH水平明显下降，SOD含量有所提高。结论缺氧对PC12细胞的增殖具有一定的抑制作用，使超氧化物歧化酶(SOD)活性降低，乳酸脱氢酶(LDH)漏出增加。异甘草素(ISL)能够逆转缺氧对PC12细胞的抑制作用，可能通过提高培养液中SOD活性，防止脂质过氧化，稳定细胞膜，降低LDH的释放，而起到细胞保护作用。

缺氧; PC12细胞; 异甘草素

缺氧(hypoxia)是指因组织的氧气供应不足或用氧障碍，而导致组织的代谢、功能和形态结构发生异常变化的病理过程。缺氧是临床各种疾病中极常见的一类病理过程，脑的缺氧也是导致机体死亡的重要原因之一。脑缺氧的原因可能与氧自由基的产生、细胞内Ca2+超载、神经递质的毒性作用、相关酶类的变化、炎症反应、线粒体功能的异常、细胞凋亡等因素相关[1]。异甘草素(ioshquiritigenin, ISL)为甘草中有效成分之一。大量文献报道，异甘草素具抗脂质过氧化[2]、有松弛血管[3]、抑制血小板聚集、抗病毒、抗肿瘤[4]及雌激素样活性[5]、抗细胞凋亡[6]等多种药理作用。本研究采用体外培养PC12细胞；建立细胞缺氧损伤模型。测定上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的含量。探讨其对缺氧神经细胞保护作用机制。

材料与方法

一、实验细胞

PC12细胞为兰州大学基础医学院惠赠，本实验室传代培养。

二、主要仪器和试剂

二氧化碳培养箱(Thermo Revco, USA)；超净工作台(美国Sigma公司)；低温高速台式离心机(UNIVERSAL116型, 德国Hetaeus公司)：倒置相差显微镜(CKX41-A32PH型, 日本Olympus公司)；紫外分光光度(Heraeus,German)；酶标仪(Bio-Tek公司)；异甘草素(天津马克生物技术有限公司产品, 批号：GC-20120203)；双染细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit, 南京凯基)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)检测试剂盒(南京凯基)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)检测试剂盒(南京凯基)。

三、分组与缺氧模型建立

细胞处理后分为C(对照组)、H(模型组，即单纯缺氧组)、H1 (异甘草素低剂量组2 μg/ml)、H2(异甘草素中剂量组4 μg/ml)、H3(异甘草素高剂量组8 μg/ml)，每组 5个复孔，待细胞贴壁后，按下表加入对应浓度的异甘草素，加药完成后放入缺氧环境中培养，开始计时，按缺氧后6 h、12 h、24 h收取细胞，同时实验。缺氧装置为自制三气通气箱，置于37℃、5%CO2培养箱内中，其内充以95%N2+5%CO2混合气体，外接传感器来来控制氧含量，进气口装有过滤膜，以此装置制备PC12细胞缺氧模型。

四、异甘草素对正常PC12细胞形态及活力的影响

取对数生长期、突起较多的细胞，胰酶消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用含10%血清的改良的Eagle培养基( Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)重悬细胞，细胞计数板计数，调整密度为l×l05个/ml，随机接种于96孔培养板中，每孔100 μl，四周边孔加200 μl PBS填充，过夜，待细胞贴壁。将实验组分为对比组，模型组， ISL 4 μg/ml，ISL 8 μg/ml，每组5个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱内培养48 h后，显微镜下观察细胞形态学改变，甲基噻唑蓝(methyl thiagolyl tetragolium, MTT)法测不同浓度ISL对PC 12细胞的影响。

五、指标检测

1.MTT法检测异甘草素对缺氧PC12细胞活力的影响：各时间点培养结束后，取出前述处理的96孔板，吸去培养液，换新鲜培养液后每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，37℃培养箱内孵育4 h，小心吸弃溶液(注意勿将结晶吸除)，加二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 150 μl/孔，震荡溶解，酶标仪490 nm处测定各孔吸光值，存活率=(各孔吸光度值/对照组吸光度值)×100。细胞活性用存活率或光密度(optical density, OD)值表示。

2.LDH活性测定：各时间点培养结束后，吸取培养液上清；按照SOD试剂盒进行加样；混匀，室温放置3 min，440 nm，测各管吸光度。

3.SOD活性测定：各时间点培养结束后，吸取培养液上清；按照SOD试剂盒进行加样；混匀，室温放置10 min，于波长550 nm处比色。

六、统计学处理

结 果

一、PC12细胞的形态学观察

正常状态下分化的PC12表现出神经元的特性，细胞形态为梭形、多角形，细胞突起长，细胞胞膜光滑，细胞间建立突触连接交联成网状(图1)，传代4 h后细胞贴壁生长，细胞分裂迅速，每2～3 d即可传代，生命力旺盛，适于实验。

二、异甘草素对正常PC12细胞形态及活力旳影响

实验表明，异甘草素浓度在10 μg/ml以下的实验组细胞存活率与正常组之间没有统计学差异，而20 μg/ml、40 μg/ml及80 μg/ml剂量组对PC12细胞有一定的毒性作用(图2)。因此我们选择10 μg/ml以下的三个剂量，即2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml剂量作为给药浓度并进行后续研究。

三、缺氧对PC12细胞活力的影响及ISL的作用

加入MTT培养4 h后细胞内生成蓝紫色结晶甲臜(图3)。左为模型组缺氧24 h后，出现多量的圆形“空泡”(如箭头所示)，此为死亡的细胞，而在右图，异甘草素8 μg/ml组缺氧24 h后，几乎未见空泡形成，而且多数细胞仍保持正常形态，有突起，未聚集成团。

MTT结果显示，对照组细胞开始计时后即进入对数期生长，细胞随时间不断分裂增殖，活力随时间增强；而模型组细胞活力明显减弱；异甘草素组缺氧后细胞活力较模型组增强，细胞存活率增高，两者之间有显著性差异(图4)。异甘草素8 μg/ml组缺氧24 h效果最为显著。

四、异甘草素对PC12细胞缺氧前后LDH活性的影响

细胞受损时，LDH可由破坏的细胞膜释放入上清，故上清中的LDH含量可以反应细胞膜受损程度。PC12细胞在缺氧后LDH漏出量明显升高，异甘草素组与模型组比较LDH明显降低(图5)。

五、异甘草素对PC12细胞缺氧前后SOD活性的影响

缺氧处理后12 h，异甘草素8 μg/ml组SOD活性显著高于模型组，缺氧24 h，异甘草素4 μg/ml组和8 μg/ml组SOD活性高于模型组，差异均有统计学意义。所有时间点异甘草素8 μg/ml组SOD活性与对照组比较无差异。自由基堆积可使脂质过氧化，对细胞造成氧化损伤，ISL可提高SOD活性，减弱因SOD活性下降引起的细胞清除氧自由基能力的降低，以此保护神经细胞。(见表1)

图1 分化型PC12细胞的病理学特征(×400)

Fig 1 Pathological characteristics of differentiated PC12 cells (× 400)

图2 MTT法测定ISL对正常PC12细胞活力的影响

Fig 2 Effect of ISL on normal PC12 cell activity was measured in MTT

bP<0.01,vsmodel group (the concentration of ISL in 10 g/ml) in the experimental group cells

图3 加入MTT培养4 h后生成蓝紫色结晶甲臜的情况(×400)

Fig 3 The blue violet crystal armour's accession to the MTT after 4 h culture (×400)

A: In ISL 8 μg/ml group, no void formation and most of the cells still maintained the normal morphology without projections or gathering into a mass at 24 h after hypoxia; B: In model group 24 h after hypoxia, a large number of circular “bubble” was observed.

图4 缺氧对PC12细胞活力的影响及ISL的作用

Fig 4 Effect of hypoxia on PC12 cell activity and the role of ISL

aP<0.05,vscontrol;aP<0.05,vsmodel group;bP<0.05,vscontrol;bP<0.05,vsmodel group.

图5 异甘草素对PC12细胞缺氧前后LDH活性的影响

Fig 5 Effect of isoliquiritigenin on activity of LDH in PC12 cells before and after hypoxia

aP<0.05,vscontrol;aP<0.05,vsmodel group.

Group0h6h12h24h Control8．41±0．229．26±0．6510．75±0．7211．91±0．88 Model8．56±0．468．47±0．358．08±0．497．76±0．57 ISL4μg/ml8．34±0．528．72±0．489．67±0．64a11．16±0．71a ISL8μg/ml8．47±0．589．09±0．5410．46±0．36b11．85±0．67b

aP<0.05,vscontrol;bP<0.05,vsmodel group.

讨 论

甘草是一味应用广泛的传统中药，也是我省四大名贵中草药之一。现代药理表明，甘草除具有镇痛、镇咳、抗炎、抗溃疡、抗变态反应等[7]作用外还具有明显的神经保护作用[8]。在神经保护方面主要有抗缺血再灌注损伤[2]，抗缺氧及改善学习[3]、记忆能力的作用[9]。异甘草素为甘草中有效成分之一。异甘草素通过改善脑的能量代谢，抗氧化的作用保护缺血再灌注损伤后的脑组织[10]。

脑缺血是由于血管狭窄，血栓形成等多种原因导致局部脑组织血流下降。此时，氧自由基增多，线粒体功能障碍，神经元凋亡，Ca2+超载等机制相互作用，相互影响，造成脑细胞功能障碍及形态学破坏。如上所述，甘草的多种活性成分能够针对这些机制，对抗脑缺血再灌注损伤。脑血管疾病在我国的发病率高，是致死、致残的重要原因之一。给家庭和社会造成了极大的负担。预防脑血管疾病的发生，提高老年人生活质量已经成为当社会最为关注的热点之一，对甘草及其活性成分的进一步研究，必将发现甘草中更多的活性物质对防治脑血管疾病具有重要意义，有望将其开发成新型药物应用于临床。

本研究显示, 异甘草素能够显著降低缺氧PC12细胞培养液上清中的LDH的含量，由此可以推测，异甘草素具有保护缺氧神经细胞膜稳定性，改善细胞膜的通透性，降低LDH的漏出量，从而稳定细胞内环境，提高神经细胞的抗缺氧能力；异甘草素还能够提高缺氧PC12细胞培养液中SOD的含量，减轻缺氧细胞的损伤程度，降低脂质过氧化引起的细胞膜损伤，保护膜的稳定性。

1Cabrerizo S, De La Cruz JP, Lopez-Villodres JA, et al. Role of the inhibition of oxidative stress and inflammatory mediators in the neuroprotective effects of hydroxytyrosol in rat brain slices subjected to hypoxia reoxygenation [J]. J Nutr Biochem, 2013, 24(12): 2152-2157.

2Zhan C, Yang J. Protective effects of isoliquiritigenin in transient middle cerebral artery occlusion-induced focal cerebral ischemia in rats [J]. Pharmacol Res, 2006, 53(3): 303-309.

3詹春, 杨静, 詹莉, 等. 异甘草素对脑缺血再灌注小鼠认知功能障碍及能量代谢的影响 [J]. 中国药理学通报, 2005, 21(2): 213-216.

4张明发, 沈雅琴. 甘草粗提物及其黄酮类成分的抗肿瘤作用 [J]. 现代药物与临床, 2010, 25(2): 124-129.

5Hajirahimkhan A, Simmler C, Yuan Y, et al. Evaluation of estrogenic activity of licorice species in comparison with Hops used in botanicals for menopausal symptoms [J]. PLoS One, 2013, 8(7): 1-11.

6Hwang CK, Chun HS. Isoliquiritigenin isolated from licorice Glycyrrhiza uralensis prevents 6-hydroxydopamine-induced apoptosis in dopaminergic neurons [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2012, 76(3): 536-543.

7Zhao X, Mei W, Gong M, et al. Antibacterial activity of the flavonoids from Dalbergia odorifera on Ralstonia solanacearum [J]. Molecules, 2011, 16(12): 9775-9782.

8Yang EJ, Min JS, Ku HY, et al. Isoliquiritigenin isolated from Glycyrrhiza uralensis protects neuronal cells against glutamate-induced mitochondrial dysfunction [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 421(4): 658-664.

9朱敏娟, 杨静. 异甘草素对丙泊酚致小鼠学习记忆障碍的影响 [J]. 数理医药学杂志, 2011, 24(2): 170-172.

10付艳玲, 薛寿儒. 氧化应激与阿尔兹海默病以及抗氧化治疗研究进展 [J]. 国际神经病学神经外科学杂志, 2010, 37(4): 336-340.

EffectofisoliquiritigeninonLDHandSODactivityinPC12cellsbeforeandafterhypoxia

JIWei,LIChangdong,LIZhiyun,SUNJianjun,FUYajie

DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofLanzhouMilitaryCommand,Lanzhou730050, China

ObjectiveEffect of isoliquiritigenin (ISL) on lactate dehydrogenase (LDH) and superoxide dismutase (SOD) in hypoxia-induced nerve cell damage was discussed.MethodsPC12 cells were cultured in vitro to establish hypoxic injury model. The cells were divided into C (control group), H (model group, namely the hypoxia group), H1 (isoliquiritigenin low dose group), H2 (isoliquiritigenin middle dose group), H3 (isoliquiritigenin high dose group). H1, H2, H3 with corresponding concentration of hormone and H were put in hypoxic environment for culture. Morphology of PC12 were observed under microscope. Lactate dehydrogenase and SOD in the supernatant lactate were determined.ResultsLDH in PC12 cells after hypoxia treatment was increased significantly, while SOD was significantly decreased. After adding isoliquiritigenin (ISL), LDH in the cell supernatant lactate was significantly decreased, but SOD was increased.ConclusionHypoxia inhibits the proliferation of PC12 cells to some extent, by reducing SOD activity and increasing lactate LDH leakage. ISL can reverse the inhibition of hypoxia on PC12 cells. It may protect the cells by improving the SOD activity in culture medium, preventing lipid peroxidation, maintaining membrane stability, and reducing LDH release.

Hypoxia; PC12 cells; ISL

1671-2897(2016)15-132-04

·论著·

R 651

A

季玮，主治医师，E-mail: 13919932236@163.com

*通讯作者： 荔志云，教授，硕士生导师，E-mail: lizhiyun456@l63.com

2014-03-21；

2014-10-28)