响应面法优化‘蛇龙珠’葡萄皮渣中多酚提取条件的研究

张建华，李敏，陈霞，杨婷，韩舜愈

(甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃 兰州 730070)



响应面法优化‘蛇龙珠’葡萄皮渣中多酚提取条件的研究

张建华，李敏，陈霞，杨婷，韩舜愈

(甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃 兰州 730070)

【目的】 为了提高葡萄皮渣中废弃物的利用价值.【方法】 以‘蛇龙珠’葡萄皮渣为原料，通过单因素和响应面试验，比较不同试验因素和水平对葡萄皮渣中多酚提取率的影响.【结果】 不同的浸提条件对多酚提取率有很大的影响.优化得到的葡萄皮渣多酚提取条件是乙醇体积分数为42.4%，料液比为1∶15.44(g∶mL)，浸提温度为60.6 ℃.【结论】 在此条件下可提取多酚的量为0.786 mg/g，与传统提取率相比有明显的增加.

葡萄皮渣；多酚；提取；响应面

多酚物质是羟基直接连接在苯环上的酚类物质及其聚合物的总称.多酚类物质广泛存在于自然界中，是植物的次生代谢产物，具有清除机体内自由基、抗脂质氧化、延缓机体衰老、预防心血管疾病、抗辐射等生物活性功能[1].

葡萄多酚主要存于葡萄籽和葡萄皮中，尤其是葡萄籽中多酚类物质含量可达5%～8%，以原花色素含量最高[1].葡萄多酚具有抗氧化、抗动脉硬化、抗癌和抗过敏等生理活性[2-3].同时作为天然抗菌剂，葡萄多酚可对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等多种细菌及皮肤真菌有抑制作用[3].因此葡萄多酚的提取开发对天然植物资源的利用、保健食品及生物制药工业的发展均有积极作用.2013年我国葡萄产量达527万t，其中80%用于酿酒，仅此一项就产生近96万t的葡萄皮渣，其中富含葡萄多酚等功效成分，因此，从葡萄皮渣中提取纯化葡萄多酚，对提高葡萄酒生产企业的经济效益十分有意义[1-3].

我国对葡萄废弃物的二次回收利用研究主要集中在葡萄籽提取物(grape seed extracts，GSE)上[4]，而在法国、意大利、西班牙等葡萄酒生产大国，葡萄废弃物利用率高达70%[2]，其中葡萄多酚已被广泛应用于食品、医药及化妆品行业.

然而，由于提取方法和提取效率的限制，葡萄皮渣中的多酚很难被充分利用[5]，有关葡萄皮渣中多酚提取条件的类似研究中得到的提取率通常为0.03‰左右[6,7]，较低的提取率不足以改良大量浪费和资源流失的现状.试验以河西产区主要的葡萄品种‘蛇龙珠’葡萄皮渣为原料，通过单因素试验和响应面试验，比较不同试验因素和水平对葡萄皮渣中多酚提取率的影响，优化得到的提取方法与其他类似文献相比，提取率有明显提高，从而使葡萄废弃物的利用价值进一步提高.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘蛇龙珠’葡萄原料于2013年10月采自甘肃省张掖市高台县南华镇，将酒精发酵结束后的葡萄皮渣于-18 ℃保存，备用.

Folin-Ciocalteus显色剂购自北京Sigma仪器生物科技有限公司；没食子酸、无水碳酸钠购于天津市光复精细化工研究所；无水乙醇购自成都市科龙化工试剂厂；所有有机溶剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

CP214电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)；HH-S型恒温水浴锅(金坛市恒丰仪器制造有限公司)；NRY-200空气恒温摇床(上海南荣试验室设备有限公司)；Genesis 10s紫外可见分光光度计(美国Thermo Scientific公司)；H2050台式高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；GZX-GF101-II电热恒温鼓风干燥(上海跃进医疗器械有限公司)；18100摩尔超水机(重庆摩尔水处理设备有限公司)；单道移液器(德国Eppendorf公司).

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的制作 参考李静等[6]的方法.称取无水碳酸钠(Na2CO3)37.50 g，溶于250 mL温水中，混匀，冷却，稀释至500 mL即为7.5%碳酸钠溶液.

准确称取没食子酸0.100 g，用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中，配成质量浓度为0.001 g/mL标准溶液.分别吸取标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL到100 mL容量瓶中，定容得到0、10、20、30、40和50 μg/mL的没食子酸标准溶液.

标准曲线的制作：分别从0、10、20、30、40和50 μg/mL没食子酸标准溶液中吸取1.0 mL，加蒸馏水5 mL、Folin-Ciocalteus显色剂1 mL，7.5%的Na2CO3溶液3 mL.阴暗处室温下显色2 h后，在765 nm波长下测定吸光度值，以没食子酸的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线.

1.3.2 葡萄皮渣的破碎 将浸渍结束后的葡萄皮渣冷冻干燥，于研钵中研磨，将研磨后的粉末作为试验原料待用.

1.3.3 样品的测定 吸取1 mL样品溶液，分别加入5 mL蒸馏水、1 mL Folin-Ciocalteus显色剂和3 mL 7.5% Na2CO3溶液.阴暗处室温下放置2 h显色后，在765 nm波长下测定吸光度，再根据标准曲线(方程)计算样品中多酚的质量浓度.葡萄皮渣多酚含量按以下公式计算：

ω=CV/m×1 000

式中，ω为多酚含量，mg/g；C为根据标准曲线计算得到的多酚质量浓度，μg/mL；V为提取液的体积，mL；m为葡萄皮渣的质量，g.

1.3.4 不同因素对多酚提取率的影响

1.3.4.1 乙醇体积分数对多酚提取率的影响 参考朱登祥等[2]的方法，称取1.000 g葡萄皮渣，分别加入装有不同体积分数乙醇溶液(20%、40%、60%、80%、100%)的三角瓶中，40 ℃恒温摇床震荡1 h，过滤，4 ℃下离心10 min，取上清液测定吸光度值.根据1.3.3的方法计算可提取的多酚含量.试验重复3次.

1.3.4.2 料液比对多酚提取率的影响 称取1.000 g葡萄皮渣于三角瓶中，加入60%乙醇溶液，使料液比分别为1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15、1∶17、1∶19(g∶mL).根据1.3.3的方法计算可提取的多酚含量.试验重复3次.1.3.4.3 提取时间对多酚提取率的影响 称取1.000 g葡萄皮渣，分别置于加入10 mL60%乙醇溶液的三角瓶中，恒温振荡0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 h.根据1.3.3的方法计算可提取的多酚含量.试验重复3次.

1.3.4.4 提取温度对多酚提取率的影响 称取1.000 g葡萄皮渣，分别置于加入10 mL60%乙醇溶液的三角瓶中，于30、40、50、60、70和80 ℃水浴1 h.根据1.3.3的方法计算可提取的多酚含量.试验重复3次.

1.3.4.5 提取次数对多酚提取率的影响 称取1.000 g葡萄皮渣，分别置于加入10 mL 60%乙醇溶液的三角瓶中，恒温振荡，每隔1 h提取一次，共提取4次.根据1.3.3的方法计算可提取的多酚含量.试验重复3次.

1.3.5 响应面试验设计 在单因素试验的基础上，选取提取温度X1，料液比X2，乙醇溶液体积分数X3为自变量，以多酚提取量为响应值，进行提取条件的优化.响应面分析因素和水平表见表1.

表1 响应面分析因素和水平表

1.4 数据分析

数据分析处理采用Design-Expert V.8.05.

2 结果与分析

2.1 总酚标准曲线

Folin-Ciocalteau法标准曲线回归方程y=0.120 8x-0.118.式中，y表示吸光度值；x表示总酚含量(以没食子酸计).标准曲线相关系数R2=0.999 6，具有很好的线性相关性，能够用于本试验的多酚含量测定.

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 The standard curve of gallic acid

2.2 葡萄皮渣中多酚提取条件的单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对多酚提取量的影响 由图2可知，多酚含量随着乙醇溶液体积分数增加而增加，当乙醇溶液体积分数达到40%时多酚含量达到最高值，之后随乙醇溶液体积分数的增加又逐渐降低，这一结果与牛春艳等[5]的研究结果相类似.这可能是过多的有机溶剂导致细胞膜变性，通透性降低，阻碍了多酚类物质的溶出[8].因此初步选择乙醇体积分数为40%.

图2 乙醇浓度对多酚提取量的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols

2.2.2 料液比对多酚提取量的影响 由图3可知，在其他条件一定的前提下，多酚含量会随着料液比的增加而逐渐升高，因为较多的溶剂可以加快整个溶媒的传质速率[8].但当料液比为1∶15(g∶mL)时多酚含量达到最大值后又下降，这是因为当料液比过高时会增大其他物质的溶出比例，间接影响了多酚的提取率[2].因此初步确定料液比为1∶15(g∶mL).

图3 料液比对多酚提取量的影响Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polyphenols

2.2.3 浸提时间对多酚提取量的影响 由图4可知，浸提时间对多酚含量影响不大，这可能是因为乙醇对多酚的提取速率较快，在1 h之内就能够充分地提取绝大多数多酚化合物[1]，所以从效率和能源节约角度考虑取1 h为宜.

图4 浸提时间对多酚提取量的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polyphenols

2.2.4 浸提温度对多酚提取量的影响 由图5可知，随着温度的升高多酚含量也逐渐增加，当温度达到60 ℃时多酚含量最高，但之后继续升温提取率逐渐降低，因为高温能够促进过氧化物的钝化和多酚的溶解，但温度过高会加速多酚物质的非酶促氧化

图5 浸提温度对多酚提取量的影响Fig.5 Effect of temperature on the yield of polyphenols

聚合，同时也会降低多酚化合物的稳定性[9].牛春燕等[5]认为浸提温度对葡萄酒渣中多酚物质提取效果影响最大，并得出葡萄皮渣中多酚物质的最佳浸提温度为60 ℃，这与本研究结果一致，所以后续试验采用60 ℃为提取温度.

2.2.5 浸提次数对多酚提取量的影响 由图6可知，随着浸提次数的增多，多酚含量先快速增加后逐渐趋于平衡，第4次提取与第3次提取时多酚含量几乎无变化，从经济效益考虑以浸提3次为宜.

图6 浸提次数对多酚提取量的影响Fig.6 Effect of times on the yield of polyphenols

2.3 葡萄皮渣中多酚物质提取条件的优化

根据单因素试验结果，因提取时间对于多酚含量没有显著影响，故选择对结果影响较大的料液比、

表2 响应面分析结果

提取温度、乙醇体积分数3个因素，利用Design-Expert V.8.05软件中的中心组合设计(CCD)选项，可获得葡萄皮渣中多酚化合物提取的三因素五水平试验设计及结果.以乙醇溶液体积分数、料液比、提取温度为变量进行通用旋转组合试验的结果见表2.

对表2进行统计分析，可建立二次回归方程：

Y=0.778 32-5.391 86X1+0.012 015X2-0.027 192X3+5.000X1X2-0.017 5X1X3-2.5X2X3-0.077 095X12-0.061 185X22-0.015 223X32

对二次回归方程进行方差分析，结果见表3.

从表3可知，二次回归方程的一次项、二次项及

交互项中的X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22、X32均表现出了显著水平，回归方程整体模型显著，且失拟项不显著，该方程的决定系数R2=0.997 1，说明回归方程的拟合比较好，误差较小，可以通过该模型预测试验结果.各因素对‘蛇龙珠’葡萄皮渣多酚提取量的影响由大到小依次为乙醇体积分数(X3)、液料比(X2)、提取温度(X1).

根据此模型获得的最优提取条件为：提取温度为60.6 ℃，浸提料液比为1∶15.44(g∶mL)，乙醇溶液的体积分数为42.4%，在此条件下多酚提取率为0.786 mg/g.

表3 方差分析结果

P<0.05表示该指标显著*，P<0.01表示该指标极显著**.

2.4 响应面结果与分析

为考察交互项对葡萄皮渣中多酚提取率的影响，经Design-Expert .V.8.05软件分析得到响应面图，见图7、8、9.

根据响应面法分析数据绘出响应面，可以直观反映出浸提温度、料液比、乙醇体积分数对可提取多酚量的影响(图 7、8、9).由响应面立体优化图可以看出，浸提温度、料液比、乙醇体积分数与可提取多酚量之间存在显著的相关性.

由图7可知，不论提取温度(X1)与料液比(X2)的增大或减小，多酚含量都在逐渐下降；在交互项对多酚含量的影响中，提取温度(X1)与料液比(X2)对试验结果的影响显著.

由图8可以看出，浸提温度从零水平逐渐减小的过程中多酚含量也在缓慢的减小，从零水平逐渐增大的过程中可提取的多酚含量迅速下降，坡度较陡；随着乙醇体积分数的减小或增大，对应的可提取多酚量也有相应的减小，但变化趋势不明显.在交互项对可提取多酚量的影响中，提取温度(X1)和乙醇体积分数(X3)对试验结果有极显著的影响.

图7 浸提温度与料液比的交互作用对多酚提取量的响应面图Fig.7 Response surface showing the pairwise interactive of temperature and solid-liquid ratio on the extraction yield of polyphenols

图8 浸提温度和乙醇体积分数的交互作用对多酚提取量的响应面图Fig.8 Response surface showing the pairwise interactive of temperature and ethanol concentration on the extraction yield of polyphenols

图9 料液比与乙醇体积分数的交互作用对多酚提取量的响应面图Fig.9 Response surface showing the pairwise interactive of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction yield of polyphenols

由图9可知，随着料液比(X2)的增大或减小，多酚含量逐渐的减小；随着乙醇体积分数(X3)的变化多酚含量也在减小，但变化不明显.这组交互项对可提取的多酚含量的影响不显著.

2.5 验证试验

根据模型获得的最优提取条件，考虑到可操作性，将其修正为提取温度61 ℃、料液比1∶16(g∶mL)、乙醇体积分数42%，在此条件进行验证试验，重复3次.测得可提取多酚的平均含量为0.776 mg/g.验证结果与理论结果较为接近，表明模型预测值与试验值之间有很好的拟合性，证实了模型的有效性.

3 讨论与结论

本试验采用三因素五水平响应面试验设计对‘蛇龙珠’葡萄皮渣多酚的提取条件进行了优化，得出最佳提取条件为：提取温度60.6 ℃，浸提料液比1∶15.44(g∶mL)，乙醇体积分数42.4%，提取次数3次，时间1 h，在此条件下多酚含量为0.786 mg/g，与传统提取率(0.03‰[6]、(0.028 9±0.002 7‰)[7])相比有明显的增加.

本试验探讨了葡萄酒生产中皮渣多酚的提取，考虑到不同多酚具有不同的生理活性，后续试验中可针对生理活性较高的多酚进行提取率的研究.

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(责任编辑 赵晓倩)

Optimization of polyphenols extraction conditions from Cabernet Gernischt wine pomace by response surface method

ZHANG Jian-hua,LI Min,CHEN Xia,YANG Ting,HAN Shun-yu

(College of Food Science and Engineering,Gansu Key Lab of Viticulture and Enology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

【Objective】 The aim of the research was to improve utilization value of grape pomace waste.【Method】 Taking Cabernet Gernischt wine lees as material,a single factor experiment and response surface experiments was used to compare the influence of different experimental factors and levels on grape polyphenols extraction rate.【Result】 The results showed that extraction conditions had greater effect on polyphenol extraction rate.The optimal extraction technology of polyphenol substances in wine lees was as follows: alcohol concentration of 42.4%,ratio of solid to liquid of 1∶15.44(g∶mL),extraction temperature at 60.6 ℃.【Conclusion】 The extractable polyphenols obtained by the method was 0.786 mg/g,was increased significantly compared with traditional extractable rate.

wine pomace；polyphenols；extraction；response surface

张建华(1989-)，女，硕士研究生，研究方向为葡萄及葡萄酒研究.E-mail:zjh930718@163.com

韩舜愈，男，教授，硕士研究生导师，研究方向为果蔬加工及葡萄酒风味化学.E-mail:gsndhsy@163.com

国家自然科学基金(31160310)；甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室建设专项基金.

2015-09-01；

2015-11-19

TS 201.2

A

1003-4315(2016)05-0141-07