促红细胞生成素通过JNK通路对再灌注损伤肺细胞凋亡的影响*

罗梓垠， 陈海娥， 宋 冬， 项冰倩， 应 磊， 王万铁

(温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所， 浙江 温州 325035)



促红细胞生成素通过JNK通路对再灌注损伤肺细胞凋亡的影响*

罗梓垠， 陈海娥， 宋 冬， 项冰倩， 应 磊， 王万铁△

(温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所， 浙江 温州 325035)

目的：探讨促红细胞生成素(EPO)后处理是否通过抑制C-Jun氨基末端激酶(JNK)活化来减轻再灌注损伤肺细胞的凋亡。方法：雄性SD大鼠40只，随机分成5组(n=8)：对照组(C组)、肺缺血/再灌注组(I/R组)、促红细胞生成素干预组(EPO组)、促红细胞生成素+溶剂对照组(P组)、促红细胞生成素+SP600125组(SP组)。各组分别于再灌注2 h留取左肺组织，电镜检测超微结构损伤；免疫组化法测定Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果：与C组相比，I/R组肺组织超微结构损伤明显，Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax比值明显降低，Bax蛋白表达明显升高(P<0.01)；EPO组、P组、SP组与I/R组相比，组织损伤有所减轻，Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax比值明显升高，Bax蛋白表达明显降低(P<0.01)；SP组与EPO组相比，组织损伤明显减轻，Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax比值明显升高，Bax蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论：I/R通过激活JNK导致大鼠肺泡结构严重破坏，肺内细胞大量凋亡；EPO可通过抑制JNK的激活而减轻I/R损伤。

缺血/再灌注；促红细胞生成素；细胞凋亡；C-Jun氨基末端激酶；SP600125；Bcl-2；Bax；大鼠

ischemia/reperfusion; erythropoietin; cell apoptosis; JNK; SP600125; Bcl-2; Bax；rats

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.024

促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种含唾液酸的酸性蛋白，对改善机体供氧状况发挥重要的调控作用。近年来研究表明，EPO是一种低氧诱导造血因子，它主要表达在肾脏，可与机体各处的 EPO受体结合，发挥对心、脑、肾等 IR器官的保护作用[1]。研究发现，EPO具有多种保护作用，如促进红细胞生成、抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用。但是，EPO是否能对肺缺血/再灌注损伤(lung ischemia/reperfusion injury, LIRI)产生作用，目前尚未见详细报道。SP600125是一种C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)抑制剂，具有高选择性和特异性，能有效阻断JNK细胞转导通路[2]，常用于JNK通路的研究。本实验应用EPO模拟后处理，意在探明在LIRI中EPO是否可以对其发挥保护效应以及这种保护作用是否与JNK有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级40只雄性SD大鼠，体重200～250 g。由温州医科大学动物实验中心提供(实验动物使用许可证号：SCXK(浙)2010-0150)。将动物随机分为5组(n=8)：对照组(C组)，缺血/再灌注组(I/R组)，促红细胞生成素干预组(EPO组)，促红细胞生成素+溶剂对照组(PPCES溶液)(P组)，促红细胞生成素+SP600125组(SP组)。C组游离左肺门后不夹闭肺门，观察2.5 h，即为假手术对照组。EPO组在大鼠造模前尾静脉注射3 000 U/kg促红细胞生成素[3]，其余操作同I/R组；P组是在大鼠造模前经尾静脉给予同体积的PPCES溶液，余同EPO组。SP组中，SP600125用药剂量为10 mg/kg体重，将10 mg SP600125充分溶解于7.5 ml PPCES溶液(30%聚乙二醇，20%聚丙烯乙二醇，15%聚氧乙烯蓖麻油，55%乙醇，30%生理盐水)中[4]，在造模前给药，余同EPO组，实验毕，处死大鼠，留取左肺组织。

1.2 动物模型的制备

根据已发表文献复制大鼠原位左肺I/R模型[5]。大鼠称重后，经腹腔注射按8 ml/kg体重剂量的5%水合氯醛进行麻醉。颈部备皮后，用组织剪逐层分离组织，暴露气管，进行气管插管，连接小动物呼吸机进行机械通气，设置呼吸机参数。消毒左侧胸部皮肤，备皮，钝性分离筋膜和肌肉，将第3、4根肋骨断开，打开胸腔，充分暴露左肺于视野内，用动脉夹夹闭左肺门30 min，此即为缺血期，继之松开动脉夹，恢复左肺血流灌注2 h，此即为再灌注期。

1.3 各组肺组织电镜检测

实验毕，处死动物，各组取左肺近肺门处组织，切成约1 mm×1 mm×1 mm大小的若干小块，立即置于2.5%戊二醛前固定，再依次经1%锇酸后固定，1%醋酸铀块染，酒精梯度脱水，丙酮浸透，Epon 812包埋聚合，行半薄切片定位，超薄切片，经醋酸铀和硝酸铅双重染色后，在电镜下观察各组标本超微结构的改变。

1.4 免疫组化法检测各组标本中Bax、Bcl-2蛋白的表达水平及其定位

操作方法遵循试剂盒所提供的说明书，Bcl-2、Bax蛋白的阳性表达是标本上呈棕褐色的部分。采用美国IPP6.0(Image-pro plus)彩色图像分析系统对Bcl-2、Bax蛋白阳性部位及背景的光密度值进行测定。阳性部位的吸光度(optical density, OD)值是阳性部位的光密度值减去背景的光密度值。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠实验模型成功率

共使用大鼠48只，依据样本排除标准，其中有40只纳入正式实验，每组大鼠8只，故实验模型复制成功率为83.3%。

2.2 电镜下各组肺组织超微结构的变化

C组各型细胞胞膜、胞内细胞器完整，细胞核清晰可见，核染色质分布均匀；I/R组各型细胞间连接疏松，胞内染色质边集、细胞器水肿，偶可见核固缩、碎裂甚至溶解；EPO组和P组超微结构损伤较I/R组有所减轻；SP组各型细胞结构完整，胞核染色质呈均匀分布(图1)。

Fig. 1 Ultrastructure changes of type Ⅱalveolar epithelial cells in each group observed by electron microscopy(×10 000)

A： Control group; B： LIRI group; C： LIRI+EPO group; D： EPO+solution control group; E： EPO+SP600125 group; LIRI: Lung ischemia/reperfusion injury; EPO: Erythropoietin

A： Control group; B： LIRI group; C： LIRI+EPO group; D： EPO+solution control group; E： EPO+SP600125 group; LIRI: Lung ischemia/reperfusion injury; EPO: Erythropoietin

**P<0.01vsC;##P<0.01vsI/R;△△P<0.01vsEPO

2.3 各组肺组织 Bax、Bcl-2蛋白的表达水平的变化及定位

Bcl-2蛋白在C组、I/R组、EPO组、P组、SP组表达量分别为0.32±0.02、0.18±0.01、0.27±0.01、0.27±0.01、0.29±0.01。Bax蛋白在各组表达量分别为0.15±0.01、0.33±0.01、0.23±0.01、0.22±0.01、0.19±0.01。各组的Bcl-2/Bax分别为2.18±0.12、0.55±0.02、1.20±0.03、1.21±0.01、1.53±0.03。与C组比较，I/R组Bax表达上升明显，Bcl-2表达明显下降，Bcl-2和Bax的比值降低(P<0.01)；EPO组、P组、SP组Bax蛋白相比于I/R组表达减弱，Bcl-2表达上升，Bcl-2和Bax比值增高(P<0.01)，与EPO组比较，Bax表达明显下降，SP组Bcl-2表达显著上升，同时Bcl-2/Bax的比值升高(P<0.01，图2)，Bax、Bcl-2蛋白阳性表达主要分布在：支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的胞浆(图3、图4，图3-4见彩图页Ⅵ)。

3 讨论

促红细胞生成素(EPO)是由成年期肾脏、胎儿期肝脏分泌的一种酸性糖蛋白类激素，体内不能储存EPO，在组织缺氧应激下产生和分泌[6]。据研究报道EPO可以使促凋亡基因Bax、DP5的表达下降，抗凋亡基因Bcl-2的表达上升，从而抑制缺氧缺血性脑损伤引起的细胞凋亡[7]。本研究中电镜下的超微结构表明，LIRI时肺泡内各型细胞、细胞器均发生明显的损伤，EPO处理后这种损伤明显减轻，说明EPO减轻了LIRI所致组织损伤和细胞凋亡。

JNK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)家族的重要成员，介导体内多种内源性信号转导途径，在细胞外各种刺激因素作用下可被激活，如：某些细胞因子、紫外线、DNA损伤因子等[8]。已有研究表明其参与了多种组织器官的I/R损伤。本实验室前期实验也已经证明LIRI时JNK过度激活，抑制JNK激活后可改善I/R损伤[9]。SP600125为JNK的特异性抑制剂，可通过C-Jun氨基末端活性区特异磷酸化位点Ser63 和Ser73以抑制JNK的表达与激活，从而减轻LIRI所致的细胞凋亡和组织损伤[2，4]。本研究中，SP组为EPO联合SP600125使用，从结果来看，SP600125增强了EPO对LIRI所致肺组织损伤和细胞凋亡的保护作用，换言之，EPO对LIRI的保护作用可能是通过抑制JNK的激活而产生的。

众所周知，Bcl-2、Bax分别通过抗凋亡和促凋亡相互作用来参与细胞凋亡的调控[10]。Bcl-2被JNK磷酸化而降解，促使其与Bax解聚，Bax则诱导线粒体凋亡途径激活，从而使细胞凋亡[11]。本研究结果证实EPO可以使Bcl-2表达上升，Bax表达下降，从而减轻细胞凋亡，而应用SP600125更是增强了这种作用。

综上所述，EPO可通过抑制JNK的活化，减轻肺组织细胞的凋亡，从而对再灌注损伤肺发挥良好的保护效应。

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