罗梓垠, 陈海娥, 宋 冬, 项冰倩, 应 磊, 王万铁
(温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所, 浙江 温州 325035)
促红细胞生成素通过JNK通路对再灌注损伤肺细胞凋亡的影响*
罗梓垠, 陈海娥, 宋 冬, 项冰倩, 应 磊, 王万铁△
(温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所, 浙江 温州 325035)
目的:探讨促红细胞生成素(EPO)后处理是否通过抑制C-Jun氨基末端激酶(JNK)活化来减轻再灌注损伤肺细胞的凋亡。方法:雄性SD大鼠40只,随机分成5组(n=8):对照组(C组)、肺缺血/再灌注组(I/R组)、促红细胞生成素干预组(EPO组)、促红细胞生成素+溶剂对照组(P组)、促红细胞生成素+SP600125组(SP组)。各组分别于再灌注2 h留取左肺组织,电镜检测超微结构损伤;免疫组化法测定Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:与C组相比,I/R组肺组织超微结构损伤明显,Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax比值明显降低,Bax蛋白表达明显升高(P<0.01);EPO组、P组、SP组与I/R组相比,组织损伤有所减轻,Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax比值明显升高,Bax蛋白表达明显降低(P<0.01);SP组与EPO组相比,组织损伤明显减轻,Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax比值明显升高,Bax蛋白表达明显降低(P<0.01)。结论:I/R通过激活JNK导致大鼠肺泡结构严重破坏,肺内细胞大量凋亡;EPO可通过抑制JNK的激活而减轻I/R损伤。
缺血/再灌注;促红细胞生成素;细胞凋亡;C-Jun氨基末端激酶;SP600125;Bcl-2;Bax;大鼠
ischemia/reperfusion; erythropoietin; cell apoptosis; JNK; SP600125; Bcl-2; Bax;rats
【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.024
促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是一种含唾液酸的酸性蛋白,对改善机体供氧状况发挥重要的调控作用。近年来研究表明,EPO是一种低氧诱导造血因子,它主要表达在肾脏,可与机体各处的 EPO受体结合,发挥对心、脑、肾等 IR器官的保护作用[1]。研究发现,EPO具有多种保护作用,如促进红细胞生成、抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用。但是,EPO是否能对肺缺血/再灌注损伤(lung ischemia/reperfusion injury, LIRI)产生作用,目前尚未见详细报道。SP600125是一种C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)抑制剂,具有高选择性和特异性,能有效阻断JNK细胞转导通路[2],常用于JNK通路的研究。本实验应用EPO模拟后处理,意在探明在LIRI中EPO是否可以对其发挥保护效应以及这种保护作用是否与JNK有关。
1.1 实验动物及分组
SPF级40只雄性SD大鼠,体重200~250 g。由温州医科大学动物实验中心提供(实验动物使用许可证号:SCXK(浙)2010-0150)。将动物随机分为5组(n=8):对照组(C组),缺血/再灌注组(I/R组),促红细胞生成素干预组(EPO组),促红细胞生成素+溶剂对照组(PPCES溶液)(P组),促红细胞生成素+SP600125组(SP组)。C组游离左肺门后不夹闭肺门,观察2.5 h,即为假手术对照组。EPO组在大鼠造模前尾静脉注射3 000 U/kg促红细胞生成素[3],其余操作同I/R组;P组是在大鼠造模前经尾静脉给予同体积的PPCES溶液,余同EPO组。SP组中,SP600125用药剂量为10 mg/kg体重,将10 mg SP600125充分溶解于7.5 ml PPCES溶液(30%聚乙二醇,20%聚丙烯乙二醇,15%聚氧乙烯蓖麻油,55%乙醇,30%生理盐水)中[4],在造模前给药,余同EPO组,实验毕,处死大鼠,留取左肺组织。
1.2 动物模型的制备
根据已发表文献复制大鼠原位左肺I/R模型[5]。大鼠称重后,经腹腔注射按8 ml/kg体重剂量的5%水合氯醛进行麻醉。颈部备皮后,用组织剪逐层分离组织,暴露气管,进行气管插管,连接小动物呼吸机进行机械通气,设置呼吸机参数。消毒左侧胸部皮肤,备皮,钝性分离筋膜和肌肉,将第3、4根肋骨断开,打开胸腔,充分暴露左肺于视野内,用动脉夹夹闭左肺门30 min,此即为缺血期,继之松开动脉夹,恢复左肺血流灌注2 h,此即为再灌注期。
1.3 各组肺组织电镜检测
实验毕,处死动物,各组取左肺近肺门处组织,切成约1 mm×1 mm×1 mm大小的若干小块,立即置于2.5%戊二醛前固定,再依次经1%锇酸后固定,1%醋酸铀块染,酒精梯度脱水,丙酮浸透,Epon 812包埋聚合,行半薄切片定位,超薄切片,经醋酸铀和硝酸铅双重染色后,在电镜下观察各组标本超微结构的改变。
1.4 免疫组化法检测各组标本中Bax、Bcl-2蛋白的表达水平及其定位
操作方法遵循试剂盒所提供的说明书,Bcl-2、Bax蛋白的阳性表达是标本上呈棕褐色的部分。采用美国IPP6.0(Image-pro plus)彩色图像分析系统对Bcl-2、Bax蛋白阳性部位及背景的光密度值进行测定。阳性部位的吸光度(optical density, OD)值是阳性部位的光密度值减去背景的光密度值。
1.5 统计学处理
2.1 大鼠实验模型成功率
共使用大鼠48只,依据样本排除标准,其中有40只纳入正式实验,每组大鼠8只,故实验模型复制成功率为83.3%。
2.2 电镜下各组肺组织超微结构的变化
C组各型细胞胞膜、胞内细胞器完整,细胞核清晰可见,核染色质分布均匀;I/R组各型细胞间连接疏松,胞内染色质边集、细胞器水肿,偶可见核固缩、碎裂甚至溶解;EPO组和P组超微结构损伤较I/R组有所减轻;SP组各型细胞结构完整,胞核染色质呈均匀分布(图1)。
Fig. 1 Ultrastructure changes of type Ⅱalveolar epithelial cells in each group observed by electron microscopy(×10 000)
A: Control group; B: LIRI group; C: LIRI+EPO group; D: EPO+solution control group; E: EPO+SP600125 group; LIRI: Lung ischemia/reperfusion injury; EPO: Erythropoietin
A: Control group; B: LIRI group; C: LIRI+EPO group; D: EPO+solution control group; E: EPO+SP600125 group; LIRI: Lung ischemia/reperfusion injury; EPO: Erythropoietin
**P<0.01vsC;##P<0.01vsI/R;△△P<0.01vsEPO
2.3 各组肺组织 Bax、Bcl-2蛋白的表达水平的变化及定位
Bcl-2蛋白在C组、I/R组、EPO组、P组、SP组表达量分别为0.32±0.02、0.18±0.01、0.27±0.01、0.27±0.01、0.29±0.01。Bax蛋白在各组表达量分别为0.15±0.01、0.33±0.01、0.23±0.01、0.22±0.01、0.19±0.01。各组的Bcl-2/Bax分别为2.18±0.12、0.55±0.02、1.20±0.03、1.21±0.01、1.53±0.03。与C组比较,I/R组Bax表达上升明显,Bcl-2表达明显下降,Bcl-2和Bax的比值降低(P<0.01);EPO组、P组、SP组Bax蛋白相比于I/R组表达减弱,Bcl-2表达上升,Bcl-2和Bax比值增高(P<0.01),与EPO组比较,Bax表达明显下降,SP组Bcl-2表达显著上升,同时Bcl-2/Bax的比值升高(P<0.01,图2),Bax、Bcl-2蛋白阳性表达主要分布在:支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的胞浆(图3、图4,图3-4见彩图页Ⅵ)。
促红细胞生成素(EPO)是由成年期肾脏、胎儿期肝脏分泌的一种酸性糖蛋白类激素,体内不能储存EPO,在组织缺氧应激下产生和分泌[6]。据研究报道EPO可以使促凋亡基因Bax、DP5的表达下降,抗凋亡基因Bcl-2的表达上升,从而抑制缺氧缺血性脑损伤引起的细胞凋亡[7]。本研究中电镜下的超微结构表明,LIRI时肺泡内各型细胞、细胞器均发生明显的损伤,EPO处理后这种损伤明显减轻,说明EPO减轻了LIRI所致组织损伤和细胞凋亡。
JNK是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)家族的重要成员,介导体内多种内源性信号转导途径,在细胞外各种刺激因素作用下可被激活,如:某些细胞因子、紫外线、DNA损伤因子等[8]。已有研究表明其参与了多种组织器官的I/R损伤。本实验室前期实验也已经证明LIRI时JNK过度激活,抑制JNK激活后可改善I/R损伤[9]。SP600125为JNK的特异性抑制剂,可通过C-Jun氨基末端活性区特异磷酸化位点Ser63 和Ser73以抑制JNK的表达与激活,从而减轻LIRI所致的细胞凋亡和组织损伤[2,4]。本研究中,SP组为EPO联合SP600125使用,从结果来看,SP600125增强了EPO对LIRI所致肺组织损伤和细胞凋亡的保护作用,换言之,EPO对LIRI的保护作用可能是通过抑制JNK的激活而产生的。
众所周知,Bcl-2、Bax分别通过抗凋亡和促凋亡相互作用来参与细胞凋亡的调控[10]。Bcl-2被JNK磷酸化而降解,促使其与Bax解聚,Bax则诱导线粒体凋亡途径激活,从而使细胞凋亡[11]。本研究结果证实EPO可以使Bcl-2表达上升,Bax表达下降,从而减轻细胞凋亡,而应用SP600125更是增强了这种作用。
综上所述,EPO可通过抑制JNK的活化,减轻肺组织细胞的凋亡,从而对再灌注损伤肺发挥良好的保护效应。
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本刊编辑部
温州市高层次人才创新技术重点资助项目(2011-05);温州市科技计划一般项目(Y20120001)
2015-05-25
2016-02-22
R363
A
1000-6834(2016)04-382-04
△【通讯作者】Tel: 0577-86689817; E-mail: wwt@wmu.edu.cn