川芎嗪对模拟失重大鼠颈动脉平滑肌Ca2+敏感性的影响*

崔艳领， 刘 甜， 孙 晗， 张 月， 冯 甜， 王慧平

(西北大学西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室， 陕西 西安 710069)



川芎嗪对模拟失重大鼠颈动脉平滑肌Ca2+敏感性的影响*

崔艳领+， 刘 甜+， 孙 晗， 张 月， 冯 甜， 王慧平△

(西北大学西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室， 陕西 西安 710069)

目的：探讨川芎嗪对模拟失重大鼠颈动脉平滑肌收缩蛋白Ca2+敏感性的影响及机制。方法：21只雌性SD大鼠分为对照组(CON)、模拟失重组(TS)、模拟失重+川芎嗪灌饲组(LTZ)(n=7)。4周后测定大鼠颈动脉收缩性、收缩蛋白Ca2+敏感性及肌球蛋白轻链激酶抑制剂ML-7对以上指标的影响。结果：TS组苯肾上腺素(PHE)收缩力比CON组高25.14%(P<0.01)，LTZ组较TS组低13.46%(P<0.01)，较CON组高8.30%；ML-7可使CON、TS、LTZ组PHE收缩力分别降低8.84%、16.24%(P<0.01)和3.40%；TS组KCl收缩力比CON组高40.46%(P<0.01)，LTZ组较TS组低18.80%，较CON组高14.05%；ML-7可使CON、TS、LTZ组KCl收缩力分别降低21.97%(P<0.05)、21.88%(P<0.01)和10.84%；TS组pD2[Ca2+]比CON组高10.03%(P<0.01)，LTZ组较TS组低7.01%(P<0.01)，较CON组高2.32%；ML-7可使CON、TS、LTZ组pD2[Ca2+]分别降低2.42%、7.43%(P<0.01)和2.51%。结论：模拟失重大鼠颈动脉收缩增强可能是由动脉平滑肌收缩蛋白Ca2+敏感性增强所导致的。川芎嗪可改善模拟失重大鼠颈动脉的收缩功能，其机制可能与抑制血管平滑肌肌球蛋白轻链激酶继而降低Ca2+敏感性有关。

模拟失重；颈动脉；川芎嗪；Ca2+敏感性；肌球蛋白轻链激酶；大鼠

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.019

(Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Northwest University, Ministry of Education, Xi'an 710069, China)

航天观察及地面实验均显示，失重/模拟失重可导致人或大鼠上/下(前/后)半身动脉血管收缩反应分别出现上调和下调这样相反的适应性变化，对这一变化发生机制及防治措施的探究一直是航天医学的热点研究内容之一。现已证实血管结构的重塑、血管平滑肌细胞的增殖与凋亡、平滑肌细胞膜表面激动剂受体数量、胞内收缩蛋白的表达等均参与了上述血管收缩功能的变化[1-6]。近年来研究进一步指出由平滑肌细胞膜上L-型钙通道和胞内肌质网上兰尼丁受体(ryanodine receptors,RyRs)介导的胞内Ca2+水平的变化亦是失重时动脉血管收缩反应性改变的重要原因[7, 8]。在胞内Ca2+诱发平滑肌细胞收缩时，其收缩强度与胞内收缩蛋白对Ca2+离子的敏感性有关。收缩蛋白Ca2+敏感性于上世纪80年代末提出，是指心肌/平滑肌收缩蛋白在收缩过程中对胞内游离Ca2+离子的敏感程度。多项研究已证实，在很多心血管疾病中出现的心肌/平滑肌收缩功能的改变均与收缩蛋白Ca2+敏感性的变化有关[9-12]。失重条件下动脉血管收缩反应性的上调下调变化是否也与平滑肌收缩蛋白Ca2+敏感性的变化相关，目前尚无此方面的报道。本研究拟对模拟失重后大鼠颈动脉平滑肌收缩蛋白Ca2+敏感性的变化进行探讨。

川芎嗪作为一种活血类中药，可通过抑制血小板聚集、提高红细胞变形能力和表面电荷、降低血液粘度等机制改善失重/模拟失重下的血流动力[13]。本课题组亦曾证实川芎嗪可有效对抗模拟失重中出现的肌萎缩[14, 15]。为进一步拓宽川芎嗪在治疗模拟失重中的应用，本实验观察了川芎嗪对模拟失重血管收缩功能的影响，并选用肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase, MLCK)特异性抑制剂ML-7研究川芎嗪改变模拟失重血管收缩功能的可能机制。通过本研究，初步明确失重条件下血管平滑肌收缩蛋白Ca2+敏感性发生的变化及其调控方式，揭示其在血管收缩功能改变中的地位和作用，为航天失重后心血管功能紊乱的防治提供新的基础资料，为传统中医药在航天医学中的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立

21只健康SPF级SD雌性大鼠(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，体重(230±20)g，随机分为3组(n=7)：对照组(control group, CON)，常规方式喂养，每日以2 ml生理盐水灌饲；模拟失重组(tail suspension group, TS)，大鼠尾部悬吊4周模拟中长期失重状态，吊尾方法参照文献[16]，每日以2 ml生理盐水灌饲；模拟失重+川芎嗪灌饲组(tail suspension plus ligustrazine group, LTZ)，大鼠同法吊尾4周，每日以2 ml川芎嗪溶液(浓度6 mg/ml)灌饲。

1.2 颈动脉血管环制备

大鼠以1.25 g/5 ml·kg乌拉坦腹腔注射麻醉，分离双侧颈动脉，去除血管周围脂肪与结缔组织后修整为长约2～3 mm的血管环，用不锈钢丝挂钩将其悬挂于内盛K-H液(恒温37℃)并通以O2的离体器官灌流浴槽中(K-H液组成mmol/L：NaCl 118, KCl 4.8, NaHCO325, CaCl22.5, MgSO41.2, KH2PO41.2, Glucose 9.8, pH 7.4)。给予初张力0.6 g，1 h后以60 mmol/L高K+液检测血管环活性(高K+液组成mmol/L：NaCl 62.9, KCl 60, NaHCO325, CaCl22.5, MgSO41.2, KH2PO41.2, Glucose 9.8, pH 7.4)，若高K+液可使其张力增加1 g左右，即为有活性血管环，备用。

1.3 颈动脉血管环收缩功能测定

选取有活性血管环，分为两组：一组采用离体血管环张力测定技术，在K-H液中加入苯肾上腺素(phenylephrine,PHE)或KCl，按照累积浓度法测定血管环对PHE(3×10-9～1×10-4mol/L)和KCl(1×10-8～3×10-5mol/L)的收缩反应性；另一组先向K-H液中加入1 μmol/L ML-7(MLCK抑制剂)，于避光条件下孵育30 min后更换K-H液，同上法测定血管环对PHE和KCl的收缩反应性。

1.4 颈动脉平滑肌收缩蛋白Ca2+敏感性测定

参照文献[17, 18]，采用离体血管环张力测定技术，按照累积浓度法测定血管环对Ca2+的反应性，用F-[Ca2+]量效曲线以及pD2[Ca2+](达到最大张力50%时的Ca2+离子浓度)评价血管钙敏感性。选取有活性血管环，向浴槽内加入120 mmol/L无Ca2+高K+液(无Ca2+高K+液组成mmol/L：NaCl 2.7, KCl 120, NaHCO325, MgSO40.45, KH2PO41.03, Glucose 11.1, pH 7.4)，内含50 μmol/L β-七叶皂苷(β-escin)和10 μmol/L A-23187。β-七叶皂苷用于透化细胞膜，以提高血管平滑肌细胞膜的通透性；A-23187可结合钙离子并通过细胞膜，从而去除胞内储存的钙。每6 min更换上述溶液一次，持续30 min后，用120 mmol/L无Ca2+高K+液检测血管环对K+的反应性。若张力无变化，则表明胞内Ca2+已去除殆尽。选取这样的血管环，在120 mmol/L无Ca2+高K+液中加入累积浓度的CaCl2(1×10-4～1×10-2mol/L)，记录血管环在CaCl2诱导下产生的收缩张力。

1.5 试剂与仪器

川芎嗪购自北京双鹤药业有限公司(许可证号No. H11021964)。PHE、ML-7、β-七叶皂苷和A-23187购自Sigma公司，其余均为国产分析纯。收缩张力由Powerlab生理信号采集系统记录。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠颈动脉的收缩反应性

PHE浓度为1×10-4mol/L时，CON组大鼠颈动脉血管环收缩张力为(1.004±0.083)g；TS组的收缩张力为(1.256±0.133)g，较CON组升高25.14%(P<0.01)；LTZ组的收缩张力为(1.087±0.070)g，较TS组降低13.46%(P<0.01)，较CON组升高8.30%。血管环经ML-7孵育后，CON组、TS组和LTZ组的收缩张力分别为(0.915±0.173)g，(1.052±0.159)g和(1.050±0.107)g，较未加ML-7血管环分别降低8.84%、16.24%(P<0.01)和3.40% (图1)。Fig. 1 Contraction of carotid artery induced by PHE in each group

PHE： Phenylephrine; CON: Control; TS: Simulated weightlessness

**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsTS group

KCl浓度为3×10-5mol/L时，CON组大鼠颈动脉血管环收缩张力为(0.833±0.107)g；TS组的收缩张力为(1.170±0.148)g，较CON组升高40.46%(P<0.01)；LTZ组的收缩张力为(0.950±0.139)g，较TS组降低18.80%，较CON组升高14.05%，均无显著性差异。血管环经ML-7孵育后，CON组、TS组和LTZ组的收缩张力分别为(0.650±0.143)g，(0.914±0.144)g和(0.847±0.107)g，较未加ML-7血管环分别降低21.97%(P<0.05)、21.88%(P<0.01)和10.84%(图2)。

Fig. 2 Contraction of carotid artery induced by KCl in each group

*P<0.05,**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsTS group

2.2 各组大鼠颈动脉平滑肌收缩蛋白的Ca2+敏感性

以各组大鼠颈动脉F-[Ca2+]量效曲线及pD2[Ca2+]代表其平滑肌收缩蛋白Ca2+敏感性。CON组大鼠颈动脉pD2为-2.763±0.072；TS组pD2为-3.040±0.057，较CON组升高10.03%(P<0.01)；LTZ组pD2为-2.827±0.102，较TS组降低7.01%(P<0.01)，较CON组升高2.32%。血管环经ML-7孵育后，CON组、TS组和LTZ组的pD2分别为-2.696±0.030，-2.814±0.032和-2.756±0.071，较未加ML-7血管环分别降低2.42%、7.43%(P<0.01)和2.51%(图3)。

Fig. 3pD2[Ca2+] value of carotid artery in each group

CON: Control group; TS: Simulated weighlessness group; LTZ: Ligustrazine administration group

**P<0.01vsCON group;##P<0.01vsTS group

3 讨论

本实验选用了PHE和KCl诱发大鼠离体颈动脉发生收缩反应，其诱发的收缩分别为动脉血管典型的受体介导收缩与非受体介导收缩。实验结果表明，模拟失重后PHE和KCl诱发的颈动脉的收缩反应均有显著升高，这与失重条件下人或大鼠上半身

血管收缩反应性增强是一致的。动脉平滑肌对受体与非受体介导的收缩反应均升高，提示失重可能会导致收缩反应的共同通路上出现异常。

受体介导与非受体介导收缩均是以平滑肌收缩装置收缩蛋白的活动为物质基础的，收缩蛋白的特性与收缩功能的形式和强度有着密切的关系。收缩蛋白的Ca2+敏感性是收缩蛋白的重要特性，收缩蛋白不同水平的Ca2+敏感性可导致血管平滑肌收缩强度不同[10, 12, 19]。本研究证实模拟失重后大鼠颈动脉平滑肌收缩蛋白的Ca2+敏感性显著增强，因此我们推断收缩蛋白Ca2+敏感性的升高可能是失重条件下颈动脉收缩功能增强的机制之一。

有关川芎嗪在对抗失重生理功能紊乱方面已有一些报道[13-15]，本研究进一步发现川芎嗪可纠正失重大鼠颈动脉异常的收缩反应，同时颈动脉的Ca2+敏感性也得以降低。这表明川芎嗪可能通过降低收缩蛋白的Ca2+敏感性从而改善了模拟失重大鼠颈动脉的收缩功能。

为深入探明川芎嗪对Ca2+敏感性的作用机制，本研究观察了MLCK(肌球蛋白轻链激酶)特异性抑制剂ML-7对各组大鼠颈动脉收缩反应的影响。MLCK是平滑肌细胞内提高收缩蛋白Ca2+敏感性最为重要的调控酶[20]。模拟失重大鼠颈动脉经ML-7作用后，其Ca2+敏感性下降，受体介导与非受体介导的收缩功能均有所回落，亦证明其收缩功能的升高与Ca2+敏感性的上升有关。而ML-7对川芎嗪灌饲的失重大鼠以上指标无明显影响，说明模拟失重+川芎嗪灌饲大鼠颈动脉内MLCK已被川芎嗪抑制。实验表明川芎嗪可通过抑制MLCK降低平滑肌的Ca2+敏感性。

可见川芎嗪可以降低模拟失重后颈动脉血管异常升高的收缩功能，其作用途径可能是通过抑制平滑肌细胞内肌球蛋白轻链激酶，继而降低平滑肌收缩蛋白Ca2+敏感性，进而改善平滑肌收缩功能。本文指出川芎嗪在对抗失重生理功能紊乱方面的一个新的作用机制，为拓宽川芎嗪在治疗航天生理疾病中的应用奠定基础。

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Effects of ligustrazine on the Ca2+sensitivity in carotid artery smooth muscle of simulated weightlessness rats

CUI Yan-ling+, LIU Tian+, SUN Han, ZHANG Yue, FENG Tian, WANG Hui-ping△

Objective: To study the effects of Ligustrazine on the Ca2+sensitivity in carotid artery smooth muscle of simulated weightlessness rats. Methods: Twenty-one female SD rats were divided into control group (CON), simulated weightlessness group (TS), simulated weightlessness plus Ligustrazine administration group (LTZ)(n=7). After 4 weeks, the contractile property and the Ca2+sensitivity in carotid artery were measured. Furthermore, the effects of ML-7(a myosin light chain kinase specific inhibitor) on above mentioned parameters were recorded. Results: Compared with CON group, the contractile force induced by phenylephrine (PHE) in TS group was increased by 25.14% (P<0.01). The force in LTZ group decreased by 13.46% (P<0.01) and increased by 8.30% compared with TS and CON group, respectively. After the artery rings were incubated with ML-7, the force in CON, TS and LTZ group were reduced by 8.84%, 16.24% (P<0.01) and 3.40%, respectively. Compared with CON group, the contractile force induced by KCl in TS group was increased by 40.46% (P<0.01). The force in LTZ group decreased by 18.80% and increased by 14.05% compared with TS and CON group, respectively. The force in CON, TS and LTZ group were reduced by 21.97% (P<0.05), 21.88% (P<0.01) and 10.84% by ML-7, respectively. Compared with CON group, thepD2[Ca2+] in TS group was increased by 10.03% (P<0.01). ThepD2[Ca2+] in LTZ group was decreased by 7.01% (P<0.01) and increased by 2.32% compared with TS and CON group, respectively. ThepD2[Ca2+] in CON, TS and LTZ group was reduced by 2.42%, 7.43% (P<0.01) and 2.51% by ML-7, respectively. Conclusion: The contraction of carotid artery is strengthened in simulated weightlessness rats, it maybe results from the Ca2+sensitivity of contractile proteins in smooth muscle increasing. Ligustrazine can improve the contraction of carotid artery, reducing the Ca2+sensitivity and inhibiting myosin light chain kinase may be involved in its mechanisms.

simulated weightlessness; carotid artery; Ligustrazine; Ca2+sensitivity; myosin light chain kinase； rats

陕西省自然科学基金项目(2013JM3001)；陕西省教育厅自然科学专项项目(14JK1755)；西北大学校级大学生创新实验项目(2014004)

2015-04-18

2016-02-23

+: 共同第一作者

Q233

A

1000-6834(2016)04-361-05

△【通讯作者】Tel: 029-88303935; E-mail: wanghp@nwu.edu.cn.