吡非尼酮对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的影响*

肖 敏, 屈小虎, 吕聚坪, 史 杨, 李长西, 谢克俭

(温州医科大学检验医学与生命科学学院， 浙江 温州 325035)



吡非尼酮对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的影响*

肖 敏, 屈小虎, 吕聚坪, 史 杨, 李长西, 谢克俭△

(温州医科大学检验医学与生命科学学院， 浙江 温州 325035)

目的：研究吡非尼酮对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的影响。方法：选用8 周健康雄性SPF级ICR小鼠40只，随机分为4组(n=10)：肝纤维化模型组(CCL4组)、吡非尼酮低剂量组(PFD-L组)、吡非尼酮高剂量组(PFD-H组)及正常对照组。CCL4肝纤维化模型采用0.4 ml/只10%的CCL4大豆油溶液进行小鼠腹腔注射制备，低剂量、高剂量吡非尼酮干预组在造模后采用120 mg/kg、240 mg/kg吡非尼酮(PFD)灌胃，正常对照组采用与前三组等量的生理盐水腹腔注射的方法。全自动生化仪检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)；取肝脏组织HE染色观察组织的病理学变化；荧光定量PCR法测定肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)相关基因的表达，酶联反应法检测肝纤维化指标透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(IV-C)。结果：与正常组相比，CCL4组小鼠肝小叶结构明显破坏，胶原纤维沉积明显，可见假小叶形成；血清ALT、AST、ALP均显著升高(P<0.05)；血清肝纤维化指标HA、LN、IV-C均显著升高(P<0.05)；α-SMA基因的表达水平也显著升高(P<0.05)。PFD-L组和PFD-H组小鼠AST、ALT、ALP相较于CCL4组明显降低，PFD-L组和PFD-H组小鼠血清肝纤维化指标HA、LN、IV-C相较于CCL4组明显降低，α-SMA基因的表达也受到抑制(P<0.05)。病理学观察发现，PFD-L组小鼠的肝纤维化程度减轻，胶原纤维减少，仅见少量假小叶；PFD-H组小鼠细胞排列恢复，小叶结构轻度紊乱，未见明显假小叶，恢复效果比PFD-L组好。结论：吡非尼酮对于肝纤维化有一定的治疗作用，其可成为肝纤维化早期干预的新药物。

吡非尼酮；四氯化碳；肝纤维化；肝星状细胞；小鼠

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.023

肝纤维化是各种慢性肝病损伤的共同结果，由于肝内纤维生成和降解失衡导致过多胶原在肝内沉积，最终可发展为肝硬化。细胞外基质(ECM)过多产生和沉积是肝纤维化的核心表现，活化的肝星状细胞是细胞外基质的主要细胞来源。故肝星状细胞(HSC)活化致使细胞外基质合成和降解失衡，是导致肝纤维化的中心环节[1]。尽管肝硬化的病理改变具有不可逆性，但是研究表明肝纤维化是一个相对可以逆转的过程。在肝纤维化阶段进行干预可能是防止肝硬化的有效途径[2]。为此阻断肝纤维化的发生和发展对于肝硬化和慢性肝病具有极为重要的意义，寻找安全有效的抗肝纤维化药物是抗肝纤维化的当务之急。

吡非尼酮(pirfenidone,PFD)是新近发现的具有抗纤维化作用的化合物，其在抑制肺、心、肾等纤维化方面的作用，目前国外已有不少报道[3-4]，而其对肝纤维化的影响尚缺少足够研究。本研究旨利用CCL4所致的肝纤维化小鼠模型，探讨吡非尼酮对肝纤维化的防治作用。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

CCL4溶液购于上海凌峰化学试剂有限公司，99.9%分析纯；CMC-Na购于广东汕头市西陇化工；大豆油采用金龙鱼大豆油，购于超市；吡非尼酮购于上海恩美生物科技有限公司；Trizol试剂购于invitrogen；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 购于宝生物工程(大连)有限公司；SYBR Green购于Bio-Rad；α-SMA引物，actin Primers 均购于生工生物工程(上海)股份有限公司。肝纤维化试剂盒购于上海博舜生物科技有限公司

1.2 仪器

全自动生化分析仪C800型(美国雅培公司)；石蜡切片机(北京中仪光科科技发展有限公司)；低温高速离心机(Eppendorf 公司)；-80℃低温冰箱(日本SANYO公司)；NanoDrop 2000 核酸蛋白分析仪(Thermo Fisher Scientific)；S1000TMThermal Cycler梯度PCR 仪(Bio-Rad)；Multifuge XIR 台式高速大容量冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific)；CFX ConnectTM荧光定量PCR 检测系统(Bio-Rad公司)。

1.3 动物模型制备

8周龄健康雄性SPF级ICR小鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)40只，体重25～30 g。适应性喂养一周。小鼠随机分为4组(n=10)：肝纤维化模型组(CCL4组)：腹腔注射0.4 ml/只10%CCL4(四氯化碳)大豆油溶液，2周注射1次，共42 d(6周)；吡非尼酮低剂量组(PFD-L组)：前2周只腹腔注射1次0.4 ml/只10%CCL4，后4周腹腔注射10%CCL4大豆油溶液(每2周1次)同时给予120 mg/kg的PFD溶液灌胃，1天1次，共 42 d(6周)；吡非尼酮高剂量组(PFD-H组)：前2周只腹腔注射1次CCL4，后4周腹腔注射10%CCL4大豆油溶液(每2周1次)同时给予240 mg/kg的PFD溶液灌胃，1天1次，共42 d(6周)；正常对照组，正常喂养42 d。各组小鼠均在实验室标准条件下饲养，自由摄取食物和水。各组小鼠造模42 d后处死，留取血清，迅速取肝组织于-80℃保存留作实时荧光定量PCR检测。

1.4 病理组织学检查

肝脏组织采用4%多聚甲醛固定，经梯度脱水后在二甲苯中透明，浸蜡，进行石蜡包埋处理后制成3 μm切片，通过苏木精—伊红染色，用ECTIPSE50I显微图像处理系统观察并收集图片，比较各组肝脏组织形态变化。

1.5 肝功能生化检测

小鼠取血后室温静置1 h, 3 000 r/min, 离心15 min，分离血清。用美国雅培C800型全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶(alanine aminotransferase， ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase， AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)。

1.6 肝纤维化指标检测

小鼠取血后室温静置1 h, 3 000 r/min, 离心15 min，分离血清。采用放射免疫分析法检测肝纤维化指标透明质酸(hyaluronic acids，HA)、层粘连蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型胶原(collagentype IV，Ⅳ-C),严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 肝组织α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin-alpha，α-SMA)基因表达检测

用实时荧光定量PCR法。采用Trizol一步法提取小鼠肝组织总RNA逆转录合成cDNA,操作按照试剂盒说明书。在实时荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增，以β-actin为内参，α-SMA引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。α-SMA上游引物:5’—AGC GGG CAT CCA CGA AAC—3’；下游引物:5’—TGA TCT TCA TGG TGC TGG GTG—3’。β-actin上游引物:5’—AAC AGT CCG CCT AGA AGC AC—3’；下游引物:5’—CAT TGA CAT CCG TAA AGA CC—3’。Real-time PCR反应体系为20 μl，其中cDNA 1 μl，SYBR Green 10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，ddH2O 8 μl，扩增程序为95℃预变性5 min,94℃变性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s,共反应45个循环。72℃延伸5 min。用SDS软件进行数据分析，用比较Ct值(循环阈值)的方法分析结果。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 体重情况

研究发现，4组小鼠体重总体均呈增长状态。其中CCL4组、PFD-L组和PFD-H组小鼠体重呈先下降后上升趋势。从增长曲线上可以看出在第28天后PFD-H组增长最快，CCL4组增长趋势在四组中是最慢的。在体重上正常组始终高于其余三组。据图可以推测PFD在后期开始发挥作用，对于肝纤维化的治疗有作用(图1)。

Fig. 1 The body weight of the mice

2.2 肝病理改变

通过HE染色观察4组模型的病理变化(图2)，结果显示：正常对照组小鼠肝小叶结构清晰完整，肝细胞多呈单核，偶有双核，以中央静脉为中心呈放射状排列，无胶原纤维增生；肝纤维化模型组小鼠肝小叶结构明显破坏，有大量的炎性细胞浸润，产生条形絮状物。纤维组织增生并向肝小叶延伸形成假小叶。部分肝细胞肿胀，成纤维细胞增生活跃，并出现脂肪变性；吡非尼酮低剂量组小鼠的肝小叶情况虽然较为紊乱，但相较于肝纤维模型组小鼠，其纤维化程度明显减轻，胶原纤维减少，纤维间隔变细，假小叶的数目也有所减少。可以看到肝窦扩张，有炎性细胞浸润，同时可以看到少量的假小叶；吡非尼酮高剂量组的肝组织病变明显减轻，肝小叶结构轻度紊乱，肝细胞散在点状坏死，排列恢复。肝窦扩张不明显，仅见少量炎性细胞浸润，胶原纤维着色减少，未见明显假小叶。

Fig. 2 Comparison of hematoxylin-eosin (HE) staining on liver tissue among four groups( ×400)

A: CCL4group; B: PFD-L group; C: PFD-H group; D: NC group

2.3 各组小鼠血清生化学指标的变化

血清生化学结果显示(表1)，肝纤维化模型组(CCL4组)ALT、AST、ALP均较正常对照组显著升高(P<0.05)；吡非尼酮低剂量组(PFD-L组)和吡非尼酮高剂量组(PFD-H组)与肝纤维化模型组相比ALT、AST、ALP值明显下降，存在显著性差异(P<0.05)；吡非尼酮高剂量组和吡非尼酮低剂量组的血清生化值相比虽然低但不存在根本性差异，无统计学意义(P>0.05)。

GroupHALNIV⁃CNC1．7099±0．02740．3142±0．01960．1965±0．0062CCL41．8357±0．0078∗0．4026±0．1622∗0．3124±0．0031∗PFD⁃L1．7498±0．0641#0．3746±0．0155#0．2937±0．0067#PFD⁃H1．7229±0．0283##△0．3411±0．0309##△0．2750±0．0049##△

NC: Normal control; CCL4: Liver fibrosis group; PFD-L: High doses of pirfenidone group; PFD-L: Low doses of pirfenidone group; ALT: Alanine aminotransferase; AST: Aspartate aminotransferase; ALP: Alkaline phosphatase

*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsCCL4group

2.4 各组小鼠血清纤维化指标的变化

血清纤维化指标结果显示(表2)，肝纤维化模型组(CCL4组)HA、LN、IV-C均较正常对照组显著升高(P<0.05)；吡非尼酮低剂量组(PFD-L组)与肝纤维化模型组相比HA、LN、IV-C值明显下降，存在显著性差异(P<0.05)；吡非尼酮高剂量组(PFD-H组)与肝纤维化模型组相比HA、LN、IV-C值明显下降，存在显著性差异(P<0.01)；吡非尼酮高剂量组(PFD-L组)和吡非尼酮低剂量组(PFD-H组)的血清纤维化指标相比存在显著性差异，有统计学意义(P<0.05)。

NC: Normal control; CCL4: Liver fibrosis group; PFD-L: High doses of pirfenidone group; PFD-L: Low doses of pirfenidone group; HA: Hyaluronic acids; LN: Laminin； IV-C: Collagentype IV

*P<0.05vsNC group；#P<0.05,##P<0.01vsCCL4group；△P<0.05vsPFD-L group

2.5 肝组织α-SMA基因的mRNA表达水平

实时荧光定量PCR法分析小鼠肝组织中肝纤维化的标志物α-SMA基因含量变化情况。结果显示，四组中与正常对照组相比，肝纤维化模型组的α-SMA基因的表达水平显著高于其他各组，同时显著性差异明显(表3，P<0.05)，说明肝纤维化造模成功。与肝纤维化模型组(CCL4组)相比，吡非尼酮低剂量组(PFD-L组)和吡非尼酮高剂量组(PFD-H组)的α-SMA基因的表达水平下降明显，具有统计学意义(P<0.05)；与吡非尼酮低剂量组(PFD-L组)相比，高剂量组的表达水平更为低，同时也具有统计学意义(表3，P<0.05)。

Groupα⁃SMA NC0．78±0．22∗CCL40．56±0．09∗PFD⁃L0．44±0．10#PFD⁃H0．43±0．09∗△

NC: Normal control； CCL4: Liver fibrosis group; PFD-L: High doses of pirfenidone group; PFD-L: Low doses of pirfenidone group; α-SMA: Smooth muscle actinalpha

*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsCCL4group；△P<0.05vsPFD-L group

3 讨论

肝纤维化是肝硬化乃至肝功能衰竭的共同病理基础和必经阶段[5]。肝硬化是全球第14位成人致死疾病，有极高的风险发展为肝癌，是全球重大的健康问题[6]。肝纤维化[7]是慢性肝损伤后组织修复过程的代偿反应，主要表现为肝星状细胞的增殖活化，活化的肝星状细胞增殖分化收缩粘附能力均增强，胶原分泌增多，使细胞外基质的沉积与降解失衡，肝脏功能受到破坏，因此对肝纤维化的预防和早期干预是稳定病情、阻止肝纤维化向肝硬化和肝癌发展的最佳措施。而要成功逆转肝纤维化就要降解过多的胶原沉积，降解过度疤痕以及协助损伤肝组织恢复到正常。吡非尼酮在抗纤维化方面已被证实有一定作用。

本实验采用CCL4制备小鼠肝纤维化模型研究PFD对肝纤维化的作用及其机制。CCL4制备的模型具有耗时短，病变典型的特点[8]。造模成功后可以发现肝细胞细胞膜发生显著变化，血清中AST、ALT、ALP外漏入血使AST、ALT、ALP含量比正常对照组显著升高，反映了肝的损伤程度。使用吡非尼酮后可以发现AST、ALT、ALP在血清中的含量显著降低，提示PFD具有减轻肝组织炎症、坏死，促进肝功能恢复的作用。

肝纤维化是以胶原为主的细胞外基质(ECM)成分合成增多,降解相对不足,在肝内过多沉积而形成。肝纤维化血清指标HA、LN、IV-C在肝纤维化时水平明显升高并与肝纤维化程度呈正相关,可以用来监测肝纤维化的发展过程和判断抗纤维化的疗效[9]。本实验发现使用吡非尼酮后可以发现HA、LN、IV-C在血清中的含量显著降低，提示PFD具有减轻肝组织炎症、坏死，促进肝功能恢复的作用。联合检测血清中HA、LN、IV-C的含量,虽然对于诊断肝纤维化及评价抗肝纤维化药物疗效有重要意义,但是还应结合病理检查,因为评价抗肝纤维化疗效的金标准是肝脏病理组织学的检查。肝脏病理组织学观察显示模型组肝细胞发生脂肪性变性、汇管区胶原纤维沉积，形成假小叶；而使用PFD的两组小鼠的肝纤维化程度减轻，对比发现PFD能有效减轻肝炎性细胞浸润，改善脂肪病变有利于肝细胞和肝组织结构、形态恢复正常。

HSC是ECM的主要来源，在慢性肝病的形成过程中，HSC发生表型转化，转化为肌成纤维细胞(myofibroblast，MyoF)，分泌大量的细胞因子导致胶原过度积累[10]。表型发生转化的HSC会特异性表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)[11,12]。研究已证实，α-SMA是HSC增殖、活化的标志[11]。实时荧光PCR实验表明肝纤维化模型的α-SMA基因表达活跃，使用吡非尼酮的两组实验组的α-SMA基因的表达水平显著降低，抑制了HSC表达，降低ECM的产生,表明吡非尼酮能通过靶向抑制HSC活化达到抗肝纤维化的作用。

综上所述，吡非尼酮(PFD)有明显的防治肝纤维化作用，其作用机制可能与其保护肝细胞、减轻炎症反应、促进胶原降解而减少细胞外基质的合成、降低α-SMA基因表达、阻断肝星状细胞激活、抑制胶原纤维增加有关。提示PFD可成为早期防治肝纤维化的新药物。

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Effects of pirfenidone on hepatic fibrosis in mice induced by carbon tetrachloride

XIAO Min, QU Xiao-hu, LV Jv-ping, SHI Yang, LI Chang-xi, XIE Ke-jian△

(Department of Biology, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

Objective: To investigate the effects of pirfenidone on CCl4-induced liver fibrosis in mice. Methods: After 8-week feeding, 40 healthy male SPF ICR mice were randomly divided into 4 groups: liver fibrosis group (CCL4group), low doses of Pirfenidone group (PFD-L group), high doses of Pirfenidone group (PFD-H group) and control group. The mice in CCL4group, low doses of Pirfenidone group (PFD-L group), high doses of Pirfenidone group (PFD-H group) were injected intraperitoneally with 0.4 ml 10% CCL4solution dissolved in soybean oil. Then the PFD-L and PFD-H groups were treated with 120 mg and 240 mg PFDviagastric gavage, respectively. Control group was injected with same volume of saline. Alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), alkaline phosphatase(ALP) in serum were tested with automatic biochemistry analyzer and the pathologic changes of liver tissue were examined by HE staining. Furthermore, we identified hyaluronic acids(HA), laminin(LN), collagentype IV(IV-C) in serum using radioimmunoassay and the expression of smooth muscle actinalpha(α-SMA) related gene in liver was tested by real-time fluorescence quantitative PCR. Results: Compared with control group, hepatic lobules in CCL4mice were damaged significantly, collagenous fiber was deposited obviously, and counterfeit hepatic lobules formed. The serum levels of ALT, AST, ALP were increased obviously (P<0.05) with the enhancement of HA, LN, IV-C in serum (P<0.05) and the expression of α-SMA related gene (P<0.05). Compared to CCL4-treated mice, the serum levels of ALT, AST, ALP in PFD-L and PFD-H groups were decreased, HA, LN, IV-C in PFD-L and PFD-H mice went down obviously，and the expression of α-SMA related gene was controlled (P<0.05). From pathological observation, we found the degree of liver fibrosis in PFD-L mice was reduced and collagenous fiber was decreased, only a little counterfeit hepatic lobule could be found. Cell arrangement in PFD-H mice recovered, the structural of hepatic lobules disordered and no obvious counterfeit hepatic lobules were found. Therefore, the recovery of PFD-H group was better than PFD-L group. Conclusion: Pirfenidone has a protective role in improving the outcome of the liver fibrosis and it may become a new direction of early intervention in liver fibrosis.

pirfenidone； carbon tetrachloride； hepatic fibrosis； hepatic stellate cells; mice

2015年度浙江省公益技术应用研究计划(实验动物)项目(2015C37099)

2015-12-29

2016-04-19

R587.1

A

1000-6834(2016)04-378-05

△【通讯作者】Tel: 13705883181; E-mail: xkj@wmu.edu.cn