巨噬细胞亚型转变在大鼠肾脏缺血/再灌注损伤中的作用*

林成成， 陆 红， 吴莲凤， 梁 勇， 陈必成， 白永恒△

(1. 温州医科大学附属第一医院外科实验室， 浙江 温州 325000， 2. 医学检验中心， 浙江 温州 325000)



巨噬细胞亚型转变在大鼠肾脏缺血/再灌注损伤中的作用*

林成成1， 陆 红2， 吴莲凤2， 梁 勇1， 陈必成1， 白永恒1△

(1. 温州医科大学附属第一医院外科实验室， 浙江 温州 325000， 2. 医学检验中心， 浙江 温州 325000)

目的：探讨巨噬细胞在大鼠肾脏缺血/再灌注损伤过程中的亚型转变及意义。方法：将30只雄性SD大鼠随机分成假手术组(Sham,n=6)和缺血/再灌组(IRI，夹闭肾动脉45 min,n=24)。IRI组分别于术后0、6、24和72 h取肾组织，每个时相组6只大鼠。用HE染色观察肾组织损伤程度；免疫组化染色检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达；实时定量RT-PCR检测巨噬细胞移动抑制因子(MIF)mRNA的表达；免疫组织荧光染色检测MIF、单核巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)以及活化巨噬细胞标志物CD68的表达，流式细胞分析检测巨噬细胞M1和M2亚型的分布特征。结果：病理结果显示大鼠肾局部损伤情况和炎症细胞浸润程度在24 h时最为严重，之后逐渐恢复。PCNA在再灌后表达明显增加，6 h达峰值，72 h表达下降。相比于正常组，再灌组大鼠肾组织中MIF的mRNA和蛋白表达明显升高；MCP-1表达则在6 h达峰值，随后下降；而CD68阳性的巨噬细胞数量明显增加，24 h达峰值，72 h表达下降。更进一步研究发现缺血/再灌注6 h时，M1亚型分布达最高值；之后随着缺血/再灌注时间延长，M1亚群相对含量开始下调，M2随之升高。结论：在肾脏缺血/再灌注早期，M1巨噬细胞介导的组织损伤发挥主要作用，随后M2型表达逐渐上调，并通过促进细胞增殖修复肾组织损伤。

肾脏；缺血/再灌注；巨噬细胞；损伤修复

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.014

缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，IRI)是指缺血组织或器官重获血液灌注或氧供后，对组织和器官所产生的损伤作用，是急性缺血性肾功能衰竭、肾实质切开取石、肾移植术等发生及转归过程中的主要肾损害方式之一[1-2]。肾IRI是急性肾功能衰竭的主要原因之一，也是移植排斥反应，尤其是慢性排斥反应的重要原因。另一方面，肾脏组织具有自我修复功能，研究发现，肾脏缺血/再灌注早期肾小管上皮细胞即可进行分裂及分化，修补损伤时缺失的细胞[3,4]。因此，肾脏缺血/再灌注时，损伤与修复并存，对疾病的预后起着决定性作用。但目前IRI时的修复机制尚未完全阐明。研究显示，巨噬细胞具有异质性，在组织稳态、炎性反应以及损伤修复中发挥着不同的功能，这主要与局部微环境炎性状态所控制的巨噬细胞表型密切相关[5,6]。但是巨噬细胞在肾组织IRI损伤修复中所起的作用及机制尚不完全明确。本研究通过建立大鼠肾IRI模型，观察IRI不同时相大鼠肾组织中巨噬细胞亚型的动态变化及功能，以探讨其在肾IRI损伤修复中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

30只雄性SD大鼠(体重220～240 g)购于温州医科大学动物实验中心，饲养于SPF级环境。饲养于(22±2) ℃室温，12 h/12 h光暗环境，自由饮水及进食(标准饲料)。所有实验动物喂养程序均严格按照温州医科大学制定的实验动物保护条例执行。

苏木精-伊红染色液(HE染色，碧云天生物公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；RNA逆转录试剂盒(日本Toyobo公司)；细胞增殖核抗原单克隆抗体(proliferating cell nuclear antigen，PCNA，美国Santa Curz公司)；MIF、MCP-1及CD68单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；流式细胞仪(美国 BD FACSCalibur)。

1.2 动物模型及分组

肾缺血/再灌注造模前大鼠均禁食1 d，10%水合氯醛(100 g/0.3 ml)腹腔内注射麻醉。缺血/再灌组(IRI，n=24)：腹部正中行2 cm切口，钝性分离右肾动脉，靠近肾门处用无创动脉夹夹闭肾动脉，右肾静脉及输尿管不夹闭，肾脏颜色逐渐由鲜红色变为暗红色，表明缺血成功。将肠管重新放回腹腔，用血管钳钳夹腹壁夹闭腹腔。45 min后打开腹腔，松开动脉夹，恢复灌流，肉眼可见肾动脉充盈，肾脏逐渐由暗红色变为鲜红色，表明再灌注成功，缝合腹壁。IRI组分别于术后0、6、24和72 h后取肾组织，每个时相组6只大鼠。假手术组(Sham，n=6)大鼠打开腹腔，分离右肾动脉，但不夹闭右肾动静脉及输尿管。

1.3 HE染色

缺血/再灌注肾取出后，横截面切开于4%多聚甲醛溶液中固定，按常规方法进行组织脱水、透明、浸蜡和包埋。切成约4 μm厚的组织切片，经脱蜡、梯度乙醇和HE染色，最后中性树胶封片。通过显微镜观察肾脏病理改变。

1.4 肾脏总RNA提取及real-time RT-PCR检测MIF的mRNA表达

采用Trizol试剂提取新鲜大鼠肾脏组织中的RNA，于260/280 nm测定吸光度值以确定样本纯度和浓度。根据试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。应用Primer 5.0软件设计针对巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)特异性引物，以β-actin作为内参对照，采用相对定量法计算获得结果。MIF的正向引物序列为5’-GTG CCA CCA CCA AAG ATA-3’，反向引物序列为5’-GGC TGA GAC AAC CCT AAT-3’；β-actin的正向引物序列为5’- CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3’，反向引物序列为5’-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’，由上海生工公司合成。相对表达量=2-△△Ct，△△Ct=[Ct目的基因(待测样品)-Ct内参(待测样品)]-[Ct目的基因(校正样品)-Ct内参(校正样品)]。采用溶解曲线分析以评价PCR结果的可靠性。

1.5 免疫组织化学染色检测PCNA的表达

用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化酶法。所有标本用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋后连续切片，厚4 μm。柠檬酸盐微波辐射进行抗原修复，二氨基联苯胺显色后经苏木精复染。以Ⅰ抗稀释液代替Ⅰ抗作为阴性对照，PCNA阳性表达为细胞核出现棕黄色颗粒。光镜下每张切片随机选取10个高倍视野(×200)，计算PCNA表达阳性的细胞数占总细胞数的比重。

1.6 免疫组织荧光染色检测MIF、MCP-1及CD68的表达

肾组织用10%多聚甲醛于4℃冰箱中固定12 h后制成石蜡切片，常规脱水、浸蜡，连续切片，厚4 μm。MIF及CD68 I 抗稀释度为1∶500；MCP-1 I 抗稀释度均为1∶200。脱蜡至水，柠檬酸盐高温修复，以 II 抗相同来源的血清封闭。以I 抗稀释液代替I 抗作为阴性对照，细胞内或胞膜出现绿色荧光为阳性表达。应用Image-Pro Plus 6.0软件分析各组石蜡切片的平均吸光度值。

1.7 流式细胞分析检测M1及M2的比例

肾组织研磨后加入细胞培养液制成细胞悬液。采用Percoll原液密度梯度离心的方法分离出浸润的巨噬细胞。取5支流式专用试管，试管1为空白对照，试管2加小鼠抗大鼠CD68—FITC，试管3加小鼠抗大鼠CD86—PE，试管4加小鼠抗大鼠CD163-Alexa Fluor 647行细胞表面染色。试管5同时加入以上3种抗体行细胞表面染色。试管2～5加入待检的细胞悬液30 μl和相应的抗体，充分混匀，室温置暗处20 min；染色完成后加1 000 μl 的 1×PBS 震荡摇匀后，以1 500 r/min，离心5 min，洗涤2次；最后加2% PFA 400 μl，震荡摇匀，上级检测。采用Calibur仪器 CellQuest软件进行3色分析，将收集到的所有细胞通过CD68-FITC和SSC作点阵图，以FITC阳性区为门R1；随后将门R1中的细胞，以CD68-FITC和CD163-Alexa Fluor 647作点阵图，以PE单阳性区为M1型巨噬细胞，Alexa Fluor 647单阳性区为M2型巨噬细胞，分析2种细胞的比例。

1.8 统计学处理

采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。组间数据比较采用单因素方差分析，两两数据比较前进行方差齐性检验，其中方差齐性者采用LSD法检验，方差不齐者采用Dunnett’s T3 法检验。若不符合正态分布则采用非参数检验。

2 结果

2.1 IRI大鼠肾组织损伤程度

如图1所示，大鼠肾组织石蜡切片经HE染色，镜下观察显示Sham组肾脏皮质区结构正常，小管管腔完整，腔面可见刷状缘，间质无充血、水肿及炎性细胞浸润。IRI 0 h时呈现典型缺血改变：细胞肿胀，部分小管刷状缘受损，少数小管上皮细胞坏死。之后，随着再灌时间延长，小管上皮细胞可见不同程度的肿胀、凝固性坏死、刷状缘脱落，呈空泡样、颗粒样变性，肾间质充血、水肿、炎性细胞浸润，其中组织损伤程度以24 h最为严重；IRI 72 h，小管间质损伤又明显减轻，炎症细胞浸润明显缓解(图1，图1见彩图页Ⅶ)。

2.2 PCNA在IRI大鼠肾组织中的动态表达

与Sham组(6.3±2.0%)相比，IRI组大鼠肾组织中PCNA表达阳性的细胞数占总细胞数的比重明显增加，IRI模型组0 h时为25.1%±5.2%(P<0.05)，6 h达到高峰，为37.4%±5.0%(P<0.05)。随后IRI组大鼠PCNA表达阳性的细胞数占总细胞数的比重逐渐下降，与6 h表达比较，24 h为24.7%±8.5%，72 h时为9.7%±1.51%，差异均有统计学显著性(P<0.05)。

2.3 MIF、MCP-1及CD68在IRI肾组织中的动态表达

如图2所示，与Sham组相比，各时间点缺血/再灌组肾组织中MIF和CD68表达均升高。缺血/再灌注后，MIF表达持续升高，到24 h达最高值，而72 h表达较前下降。这些因子的表达改变反映肾局部组织中巨噬细胞浸润、迁移和活化的动态改变。而MCP-1表达在IRI后迅速升高，在6 h 便达到顶峰，随后表达下降(图2，图2见彩图页Ⅶ)。如图3所示，免疫组织荧光定量分析显示，CD68阳性巨噬细胞表达在IRI后也迅速升高，24 h达到最高值(P<0.05)，72 h则表达下降(图3，图3见彩图页Ⅶ)。

如图4所示，RT-PCR检测MIF mRNA发现，相比于正常组，再灌组大鼠肾组织中MIF的mRNA相对水平明显升高，并且于24 h达峰值(P<0.05)，72 h表达明显下降。

*P<0.05vssham;#P<0.05vsIRI 24 h group

2.4 M1和M2亚群的巨噬细胞数目在IRI模型中的分布

表1给出了M1和M2亚群的巨噬细胞数目在IRI模型中的分布情况，结果显示，假手术组模型基本为M2亚型。缺血起始阶段，IRI模型组M1相对含量开始升高，而M2亚型则明显下降(P<0.05)；到缺血/再灌6 h时，M1亚型分布达最高值(P<0.05)，而M2亚型相对含量则最低(P<0.05)；之后，随着缺血/再灌时间延长，IRI模型组M1亚群相对含量又逐渐下调，M2随之升高。

GroupM1macrophages/totalmacrophagesM2macrophages/totalmacrophagesSham0．002±0．0010．998±0．092IRI0h0．014±0．004∗#0．981±0．103#IRI6h0．131±0．012∗0．866±0．099∗IRI24h0．032±0．003∗#0．966±0．114#IRI72h0．025±0．001∗#0．973±0．087#

*P<0.05vssham;#P<0.05vsIRI 6 h group

3 讨论

肾缺血/再灌注损伤(IRI)是临床上引起急性肾损伤最主要的病因[7]，也是肾脏移植术后影响移植物早期功能恢复及长期存活的主要因素之一[8]。因此，积极寻找IRI的防治手段显得尤为迫切。而作为活化巨噬细胞标志物，CD68阳性细胞水平在IRI后迅速上升并于24 h达峰；这证明了巨噬细胞是参与肾脏IRI过程中十分重要的白细胞种类，在不同阶段发挥着不同作用。更进一步，巨噬细胞不仅造成肾脏损伤，同时与肾脏修复也密切相关。然而，巨噬细胞亚型在肾脏IRI过程中转化及相关机制尚不完全明确。

巨噬细胞具有功能可塑性，在不同的微环境中，呈现诱导组织损伤或促进损伤修复的不同功能状态，这主要与其不同亚型差异表达密切相关[5, 6, 9]。巨噬细胞可极化为两种亚型，经典活化的M1型巨噬细胞(HLA-DR/CD68)导致炎性和免疫损伤，选择性活化的M2型巨噬细胞(CD163/CD68)降低炎症反应，发挥组织修复功能。在肾缺血/再灌注损伤过程中，传统观念认为早期以M1促进炎性反应为主，通过分泌炎性介质如TNF-α，IL-1，IL-6等加重肾损伤[10]；随着病程进展，M1型巨噬细胞逐渐转化为促进修复的M2型为主。我们的研究证实在正常肾组织中，M2型占绝对优势。在缺血/再灌注开始时，M1相对含量便迅速增多，于6 h达到高峰，而此时M2相对含量最低。随后，M1相对含量下降，M2相对含量上升。然而实验中缺血/再灌注肾组织病理损伤最为严重出现在24 h。这一结果提示M1巨噬细胞介导的损伤过程可能在超早期迅速启动并在6 h达到高峰，此后虽然M2巨噬细胞相对含量逐渐增多，但在这个过程中IRI损伤仍占绝对优势并持续到24 h。随后，M2介导的修复过程逐渐占据优势， IRI后72 h时肾组织损伤已明显修复。

MIF是一种广泛存在于免疫、内分泌及神经系统的促炎性因子，在多种炎性疾病的发生和发展中有重要作用。MIF在肾脏内主要由巨噬细胞表达，并直接作用于巨噬细胞，抑制其游走，促进其在炎症部位的聚集、增生、活化及分泌一些细胞因子如IL-1和TNF-α[11]；与肾组织损害及功能衰退有密切关系。有研究显示给大白兔注射肾毒血清和抗MIF中和抗体，能有效地防止肾组织损害的发生与发展[12]。我们研究发现，在肾脏IRI早期，MIF表达持续升高，24 h达最高值，促进M1巨噬细胞的聚集、增生、活化及分泌炎性介质而加重肾损伤。这与实验中缺血/再灌注24 h时巨噬细胞表达达峰并导致组织损伤最严重保持一致。不同的是，MCP-1在6 h表达即达峰，与其他研究结果基本一致[13]。MCP-1作为重要的趋化因子之一，对单核巨噬细胞具有趋化和激活作用，可以调节其向肾组织浸润，促进溶酶体的释放和氧自由基大量产生，造成组织损伤[13]。这些结果表明巨噬细胞在IRI 24 h内主要表现为损伤作用，提示M1亚型此时占主导作用。

另一方面，众多组织及功能试验发现，M2巨噬细胞具有强大的组织损伤修复功能。在肾脏IRI等引起的肾脏组织损伤后，M2巨噬细胞可以刺激包括肾小管上皮细胞在内的众多细胞类型的增殖再生。一方面，这可能与抑制经典活化的M1巨噬细胞，减少促炎因子和iNOS的产生有关[14]。M2巨噬细胞还可以吞噬受损细胞和细胞废墟。另外，M2巨噬细胞产生抗炎细胞因子，抑制效应淋巴细胞的功能和增殖。近年来研究还发现，IRI损伤修复过程中巨噬细胞的保护作用可能与IL-10有关。两者之间可形成正反馈。因此，巨噬细胞是肾损伤与修复的关键免疫细胞。众多研究表明，干预巨噬细胞或其功能的治疗对包括肾缺血/再灌注在内的不同类型肾脏疾病均具有改善作用，可以成为治疗肾脏疾病的潜在手段。

PCNA(DNA聚合酶δ辅助蛋白)与细胞DNA合成关系密切，在启动细胞增殖方面发挥重要作用。我们发现，作为反映细胞增殖的敏感指标，PCNA在肾脏缺血/再灌注后6～24 h达到高峰，而在修复最显著的72 h反而呈下降趋势。这一结果更进一步提示虽然M2巨噬细胞介导的修复过程可能在超早期即已开始，细胞增殖在6～24 h迅速达到高峰，但此时IRI损伤仍占绝对优势，且增殖细胞尚未成熟，导致24 h肾脏组织损伤仍最为严重。24 h后修复细胞增殖速率较前下降，但增殖细胞逐渐成熟，修复逐渐占据优势， IRI后72 h时肾组织损伤已明显修复。另外，最近研究发现，在IRI早期采用氯磷酸盐脂质敲除小鼠全身单核巨噬细胞，细胞增殖显著减少，肾脏组织病理损伤明显加重[15]。据此，我们推断，M2巨噬细胞介导的修复作用在IRI整个过程中占据主导位置，但在0～6 h时M1巨噬细胞比例迅速上升并达峰，导致0～24 h时损伤占优势。

综上所述，在肾脏缺血/再灌注早期，虽然M1巨噬细胞介导的组织损伤占据绝对优势，但巨噬细胞已开始逐渐恢复为M2型，通过促进细胞增殖对组织损伤进行修复。本研究为超早期干预巨噬细胞及其功能，减少肾脏组织损伤并促进恢复的研究提供了基础。但其详细的作用机制及分子通路尚不明确，需要进一步研究。

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The role of sub-transform of macrophages in renal ischemia/reperfusion injury in rats

LIN Cheng-cheng1, LU Hong2, WU Lian-feng2, LIANG Yong1, CHEN Bi-cheng1, BAI Yong-heng1△

(1. Wenzhou Key Laboratory of Surgery, the First Affiliated Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000;2. Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital, Wenzhou Meical University, Wenzhou 325000, China)

Objective: To investigate the role of sub-transform macrophage in ischemia/reperfusion renal injury in rats, as well as underlying mechanisms. Methods: Thirty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into ischemia/reperfusion (IRI,n=24, renal artery was occluded for 45 min) group and sham-operation (Sham,n=6) group. The kidneys in IRI group were collected at 0, 6, 24 and 72 h after operation (6 rats for each time point). The injury of the kidney was detected with HE staining. Immunohistochemistry staining was performed to evaluate the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of macrophage migration inhibitory factor (MIF). Moreover, the expression and location of MIF, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and macrophage marker CD68 were examined by immunofluorescence staining. Most importantly, the distribution of macrophage subtypes M1 and M2 was analyzed by flow cytometry. Results: The worst pathologic damage of the renal tissues, as well as infiltration of inflammatory cells, was observed at 24 h after operation in IRI rats, with obvious recovery afterwards. Immunohistochemistry staining showed that the expression of PCNA was significantly increased after the ischemia/reperfusion, peaking at 6 h and reducing at 72 h after operation. Compared with sham group, the levels of MIF at mRNA and protein levels were both significantly increased after the ischemia/reperfusion, while the expression of MCP-1 was peaked at 6 h and decreased afterwards. Moreover, the expression of CD68-positive macrophages were significantly increased in IRI rats, with peaking at 24 h and reducing at 72 h. Furthermore, after 6 h of reperfusion, the percentage of M1 macrophages reached the peak, and thereafter the relative expression of M1 and M2 was reduced and increased, respectively. Conclusion: In the early phase of ischemia/perfusion renal injury, M1 macrophage results in renal damage, and afterwards the M2 macrophage is increased and repairs the renal damage by improving the cell proliferation.

kidney; ischemia/reperfusion; macrophage; injury and recovery

浙江省自然科学基金(LY16H310005)；温州市科技局项目(Y20130094,Y20150095)

2015-11-12

2016-04-03

R692; R363.2

A

1000-6834(2016)04-338-06

△【通讯作者】Tel： 0577-88069338； E-mail： greatsailor@163.com