大鼠肺细小动脉平滑肌细胞培养新方法的建立及血小板衍生因子对其增殖迁移的影响*

朱 宁， 赵旭勇， 向贻佳， 曾春来

(温州医科大学附属第五医院心内科， 浙江 丽水 323000)



大鼠肺细小动脉平滑肌细胞培养新方法的建立及血小板衍生因子对其增殖迁移的影响*

朱 宁， 赵旭勇， 向贻佳， 曾春来△

(温州医科大学附属第五医院心内科， 浙江 丽水 323000)

目的：建立一种操作简单、实验仪器要求低的大鼠肺细小动脉平滑肌细胞(PASMCs)分离和培养的方法，并且探索血小板衍生因子(PDGF)介导的增殖、迁移的情况。方法：向右心注射铁及琼脂糖，利用琼脂糖能同时粘附血管内皮细胞、平滑肌细胞及铁粉，再结合胶原酶I的消化，通过磁力架吸引铁，特异性地分选出带血管的肺组织，经过3～4周左右的培养及纯化，得到肺细小动脉平滑肌细胞。用倒置相差显微镜观察细胞形态，免疫细胞化学法和免疫荧光染色法进行α-平滑肌肌动蛋白鉴定。MTT实验和划痕实验检测PDGF诱导的肺动脉细小平滑肌细胞的增殖和迁移。结果：分离后第14天、第21天及传代后进行鉴定，均表明分离培养的细胞为PASMCs。MTT结果表明，与不加PDGF组相比，PDGF增殖明显增加(P<0.05)。划痕实验结果显示PDGF刺激组比不刺激组迁移显著增多。结论：本方法分离培养大鼠的PASMCs，操作方便，实验仪器要求低。PDGF能够促进肺细小动脉平滑肌细胞的增殖、迁移。

肺动脉平滑肌细胞；大鼠；分离；原代培养。

【DOI】 10.13459/j.cnki.cjap.2016.04.015

肺动脉高压是一种不可逆转，致死率很高的严重疾病。前列环素、内皮素拮抗剂和5型磷酸二酯酶抑制剂是目前用于肺动脉高压治疗的主要药物，它们具有舒张血管及较弱的抗血管平滑肌细胞增殖

能力。它们能改善肺动脉高压患者的生存质量，但是依然不能降低死亡率[1]。所以还有待进一步研究肺动脉高压的发病机制以及开发新的治疗药物。越来越多的研究表明肺细小动脉平滑肌细(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)的增殖、迁移导致的肺小动脉重构在肺动脉高压发生、发展过程中起到了决定性的作用[2-4]，所以获得原代的PASMCs对于肺动脉高压病理生理机制以及分子机制的研究有重要的意义。同时PASMCs也能应用于肺动脉高压治疗药物的作用机制研究。近年来有文献报道了PASMCs的原代分离方法[5,6]，但这些分离方法均需在体视显微镜下剥离肺内细小动脉，然后进一步分离PASMCs。首先这些方法对实验设备有特别的要求(需在体视显微镜下操作)，这在一定程度上限制了方法的推广，增加实验的成本。其次，且肺细小动脉相对较细，手动剥离操作难度较高。本实验经过不断探索和研究，找到一种操作简单，仪器设备需求低的PASMCs分离方法。同时初步证明了血小板衍生因子(platelet-derived growth factor, PDGF)同样刺激能分离传代得到的大鼠肺细小动脉平滑肌细胞增殖和迁移。

1 材料与方法

1.1 主要材料

(250±20)g健康SD大鼠购自上海动物实验中心;DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青-链霉素 (双抗)、 Hank’s 液及 PBS液购自Hyclone；胶原酶 I，α肌动蛋白单克隆抗体 (α-SMA),牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，铁粉购自Sigma公司，MTT试剂盒购自碧云天；琼脂糖购自Denville公司；鼠二步法检测试剂盒购自基因科技(上海)有限公司；异硫氢酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)，羊抗小鼠IgG购自Invitrogen公司，MTT试剂盒购自碧云天。

1.2 PASMCs的培养

1.2.1 原代PASMCs分离方法 (1)配制所需溶液：右心注射液：10 ml DMEM+50 mg琼脂糖+50 mg铁粉；肺灌注液：10 ml DMEM+50 mg琼脂糖；完全培养基：10%FBS的 DMEM；消化溶液：胶原酶I2.1 mg加入10 ml DMEM中。(2)麻醉大鼠：健康雄性SD大鼠鼠，用10%水合氯醛0.8 ml经腹腔注射麻醉，放入75%乙醇中浸泡3～5 min。(3)处死及注射前准备：打开腹腔，剪断腹主动脉，流水冲洗，尽量使全身血液流尽，在无菌操作台快速剪开颈部，5 ml一次性注射器针头插入气管，结扎固定。迅速打开胸腔，暴露右心室。(4)液体注射：右心注入10 ml PBS，去除肺循环内血液。预先配制的右心注射液煮沸，放置冰上冷却至37℃左右，用5 ml一次性注射器注射10 ml右心注射液，可以看到肺内细小血管变成黑色，证明注射成功。气管内注射10 ml的肺灌注液。(5)分离含肺细小动脉的肺组织：取出肺脏置于加双抗的Hank’s液中洗涤后稳定5 min，再移到新的10 ml Hank’s液中，剪碎肺组织。(6)洗涤：在含肺组织的将溶液倒入50 ml离心管内，放置于磁力架上，可以看到所需要的组织被吸引到一边，小心弃去废液和无用组织，再加入含有双抗的PBS漂洗3次。(7)消化：用预先配制的10 ml消化液重悬肺组织，移到10 cm培养皿，37℃孵育2 h。(8)再次漂洗：用上面的方法洗涤肺组织，加入5 ml完全培养基接种于6 cm培养皿，37℃、CO2培养箱培养。(9)纯化：分离后的第2天弃去上清，PBS重悬，移入50 ml离心管，磁力架吸引下PBS洗3次，用完全培养基重悬，第6天、第9天进行同样的操作，可留下含有肺细小动脉的组织。(10)等到分离后的13 d镜下可见一些平滑肌细胞迁出，弃去培养液，温的PBS洗3次，胰酶消化，轻柔吹打，静置5 min。加入5 ml完全培养基，移到50 ml离心管中，磁力架吸引残留的铁粉，这次吸取上清就是需要的平滑肌细胞，同时去除铁粉。将上清移到6 cm培养皿中培养，需要1～2周后可见细胞长满培养皿, 即可行传代培养。

1.2．2 PASMCs的传代培养 当培养的细胞生长达培养瓶80%～90%时，弃去培养液，用2 ml PBS清洗培养皿2～3次，加入1 ml 0.25%胰酶，轻柔吹打数次培养皿，静止5 min,镜下观察到大量细胞悬浮在培养基里时加入含10%血清培养基终止消化，反复吹打制成细胞悬液，8 000 r/min,5 min。小心弃去上清液，注意不要吸到离心管底下细胞，加10 ml含10%FBS的DMEM培养液,置于37℃的CO2培养箱中继续培养。每隔3～5 d换液，细胞传至3～5代可冻存用于实验。

1.3 PASMCs的纯化

PASMCs 本身相对于内皮细胞、成纤维细胞有绝对的生长优势，在培养过程中内皮细胞及成纤维细胞均会逐渐消失，平滑肌细胞的纯度会逐渐上升，但可能需要多次传代。因为相对于较少的内皮细胞而言，成纤维细胞在细胞从血管迁出开始时数目基本与平滑肌细胞相等。

1.4 PASMCs的鉴定

1.4．1 细胞形态鉴定 倒置显微镜下观察原代培养细胞的形态,并摄片保存。

1.4．2 免疫组化鉴定 (1)取分离后14 d的PASMCs接种于底部放置盖玻片的6孔板中，培养1～2 d。(2)弃去培养液， PBS漂洗爬片的细胞，5 min×3次。 (3)4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗5 min×3次。(4)用BSA(PBS配制)室温封闭1 h。(5)加入小鼠源性α-肌动蛋白单克隆抗体(稀释比1∶400，PBS配制)，4℃过夜。(6)PBS液漂洗5 min×3次，滴加免疫组化试剂盒抗小鼠二抗，室温孵育1 h。(7)PBS漂洗5 min×3次。(8)DAB溶液显色,在镜下控制显色程度，用苏木素复染细胞核，清水漂洗。(9)在75%→95%→95%→100%→100%浓度乙醇中梯度脱水，最后中性树胶封片。

1.4．3 免疫荧光染色法 鉴定取分离后21 d及传代培养的PASMCs接种于底部放置盖玻片的6孔板中，培养1～2 d。(2)弃去培养液， PBS漂洗爬片的细胞，5 min×3次。(3)4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗5 min×3次。(4)用BSA(PBS配制)室温封闭1 h。(5)加入小鼠源性α-肌动蛋白单克隆抗体(稀释比1∶400，PBS配制),4℃过夜。(6)PBS液漂洗5 min×3次，滴加二抗 (FITC标记兔抗小鼠)，孵育1 h。(7)PBS漂洗5 min×3次。滴加细胞核染色液DAPI(10 μg/ml)室温孵育3～5 min,倒置荧光显微镜下对同一视野以不同激发波长(FITC: 450～490 nm和PI:515～560 nm) 观察并摄片。

1.5 MTT实验

取生长良好的对数生长期细胞，消化后接种于96孔板，用含10%FBS的DMEM培养1 d等细胞贴壁即可实验。弃去培养液,PBS漂洗，加入含0.5% FBS的DMEM饥饿48 h。弃去培养液，PBS漂洗，加入新的0.5% FBS的DMEM，一组加入PDGF，终浓度为20 ng/ml，一组则不加。根据试剂盒说明，每孔加入10 μl MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4 h.每孔加入100 μl Formanzan溶解液，在细胞培养箱内再继续孵育。直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解。37℃孵育4 h，紫色结晶会全部溶解。最后检测570 nm波长附近的吸光度。

1.6 划痕实验

细胞饥饿预处理同MTT实验，用200 μl枪头在培养皿中间划一条线，弃去培养液，PBS漂洗3次，加入新的0.5% FBS的DMEM。一组加入PDGF，终浓度为20 ng/ml，一组则不加。24 h后相差倒置显微镜下观察细胞在划痕处的迁移情况。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 细胞生长情况

倒置相差显微镜下，刚消化后第6天前的部分细小动脉形态仍可见，同时有黑色铁粉沉积，显示其为需要获得的细小动脉(图1A)；14 d之后细胞呈不规则形状、透亮、单个或呈细胞团分布，少量未贴壁细胞上浮(图1B)；21 d后可见贴壁细胞数量明显增多，多呈梭形，或呈三角形等形状(图1C)，细胞可铺满80%～90%的6 mm的培养皿。细胞传代培养后仍能保持原来的形态特点(图1D，图1见彩图页Ⅷ)。

2.2 鉴定结果

免疫组织化学结果显示分离后第21天的细胞能表达α-SMA，细胞胞浆呈棕黄色，胞质中有细丝状物质，为肌动蛋白(图2，图2见彩图页Ⅷ)，说明有效地分离出了PASMCs，细胞共计901个。同时免疫荧光染色也表明在分离后第21天以及传代培养后，98%的细胞都能表达α-SMA，说明分离的细胞绝大部分为PASMCs(图3A,B),共计868个PASMCs;传代后100%为PASMCs(图3C,D，图3见彩图页Ⅷ),共计1211个PASMCs。

2.3 MTT法检测细胞增殖结果

用MTT法检测时，吸光度与细胞数目相关，细胞增殖越多吸光度越强。结果显示PDGF组吸光度明显高于对照组(0.110±0.005vs0.035±0.003，P<0.05)，说明PDGF组细胞增殖明显。

2.4 划痕实验检测细胞迁移结果

培养皿中间划出一条没有细胞的区域，平滑肌细胞可缓慢迁移到空白处，以此检验细胞的迁移情况。如图4显示，与对照组相比，PDGF组迁移到中间无细胞区域数量明显增多(58±2vs19±3，P<0.01)，提示PDGF能有效刺激细胞的迁移(图4，图4见彩图页Ⅷ)。

3 讨论

由于肺动脉高压的肺循环疾病到目前是治疗的难点，体外培养的PASMCs有重要的研究价值。深入研究肺细小动脉平滑肌细胞增殖、迁移功能及分子机制能了解肺动脉高压的发生、发展和药物研究的药理学机制。

由于肺细小动脉处于肺循环的终末段，分离得到原代的PASMCs存在很大的技术难度。之前也有一些文献报道了PASMCs的分离方法，但大多采用体视显微镜下分离，操作繁琐，并且对仪器设备要求较高，这很大程度上限制了这些方法的推广应用。本文建立的方法在设备上仅需一般的倒置相差显微镜即可，主要是利用琼脂糖同时吸附血管内皮细胞和铁粉，而铁粉颗粒的大小正好使得它们能沉积在肺细小动脉中，再用磁力架吸引铁粉，这样经过胶原酶I就能筛选出带有肺细小动脉的肺组织，经过大约3周左右的培养和纯化，就能得到较纯的PASMCs。

同时本方法经适当改良完全可用于小鼠的PASMCs，对于基因敲除和导入小鼠的体外研究意义重大，而且操作上与大鼠相比，难度并没有明显增加。而之前也有文献报道用体视显微镜分离小鼠的PASMCs,则操作上会更加困难，所以本方法具有广泛应用的前景。本实验虽然方法简单，但与之前直接剥离PASMCs的方法相比分离的效率不是特别高，所需时间也相对较长。采用钱国清等人[5]的方法一周左右即可获得较纯的PASMCs，但是本方法大约需要3周才能获得足量的较纯的PASMCs。当然也可采用多只大鼠同时进行，可提高获得PASMCs的效率，同时也更有利于细胞贴壁及生长。

正常情况下血管平滑肌细胞发挥维持血管可塑性的作用，而当应对如压力、血管剪切力、炎症等外界环境刺激，会通过减少收缩状态的标志物而发生表型转换。此时血管平滑肌细胞的迁移、增殖和基质合成增加[7,8]，这也是许多心血管疾病如肺动脉高压[9]、冠状动脉粥样硬化[10]、血管成形术后再狭窄[11]等。虽然孟立平等人[12]采用同型半胱氨酸诱导的方法来研究黄酒活性成分对血管平滑肌细胞的增殖、迁移的影响，但是PDGF刺激平滑肌细胞的增殖、迁移，是研究平滑肌细胞功能最经典的方法，应用也最广泛[13]。本实验证明分离得到的PASMCs也像一般平滑肌细胞受PDGF刺激后增殖、迁移明显增加，完全可用于PASMC过度增殖、迁移导致的肺动脉高压机理和药理学的研究。

实验过程中，需要注意一下几点：(1)开始放血一定要尽量放干净，以免小的血栓堵在肺细小动脉，导致铁颗粒无法进入；(2)操作应该在无菌手术台进行，所用手术器械均应该消毒，分离组织后需放入加双抗的Hank’s 液中清洗及其他操作，避免细胞污染；(3)所用琼脂糖必须是低熔点的；(4)注射到大鼠体内的混合溶液需先煮沸，而后冰上降温到37℃左右，避免烫伤细胞；(5)剪碎组织后需保持在低温状态，使得铁粉琼脂糖混合溶液处于凝固状态，避免铁粉进入气管，粘连在气管平滑肌细胞上；(6)分离得到的肺细小动脉最后一次利用磁力架清洗时赢尽量去除铁粉，长期暴露于铁粉可能影响细胞的氧化还原平衡。

本实验方法获得PASMCs操作简单 ,实用性强，易于推广，能为更好地防治肺动脉高压打下坚实的基础。

[1] Michelakis ED.Pulmonary arterial hypertension: yesterday, today, tomorrow[J].CircRes, 2014, 115(1): 109-114.

[2] Hoeper MM, Mayer E, Simonneau G,etal. Chronic thromboembolic pulmonary hypertension [J].Circulation, 2006,113(16): 2011-2020.

[3] Courboulin A, Paulin R, Giguere NJ,etal. Role for miR-204 in human pulmonary arterial hypertension [J].JExpMed, 2011, 208(3): 535-548.

[4] Rabinovitch M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension [J].JClinInvest, 2012,122(12):4306-4313.

[5] 钱国清, 王良兴, 陈 婵, 等. 大鼠细小肺动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定方法的研究[J]. 中国应用生理学杂志, 2010, 26(1): 125-128.

[6] 虞晓明, 郭 瑞, 唐江锋, 等. 小鼠肺细小动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定以及低氧对其增殖与凋亡的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2014, 30(9): 1724-1728.

[7] Owens GK, Kumar MS, Wamhoff BR. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease[J].PhysiolRev, 2004, 84(3): 767-801.

[8] Owens GK. Regulation of differentiation of vascular smooth muscle cells[J].PhysiolRev, 1995, 75(3): 487-517.

[9] Savai R, Al-Tamari HM, Sedding D,etal. Pro-proliferative and inflammatory signaling converge on FoxO1 transcription factor in pulmonary hypertension[J].NatMed, 2014, 20(11): 1289-1300.

[10]Roque M, Kim WJ, Gazdoin M,etal. CCR2 deficiency decreases intimal hyperplasia after arterial injury[J].ArteriosclerThrombVascBiol, 2002, 22(4): 554-559.

[11]Li P, Zhu N, Yi B,etal. MicroRNA-663 Regulates human vascular smooth muscle cell phenotypic switch and vascular neointimal formation[J].CircRes, 2013, 113(10): 1117-1127.

[12]孟立平， 周昌钻， 郭 艳， 等. 黄酒中抑制同型半胱氨酸诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移成分探讨[J]. 中国应用生理学杂志, 2015, 31(5): 437-442.

[13]Tallquist M, Kazlauskas A. PDGF signaling in cells and mice[J].CytokineGrowthFactorRev, 2004, 15(4): 205-213.

A method of primary cell culture of rat pulmonary artery smooth muscle cells and effects of platelet-derived growth factor induced proliferation and migration

ZHU Ning, ZHAO Xu-yong, XIANG Yi-jia, ZENG Chun-lai△

(Cardiovascular Department, the Fifth Affiliated Hospital, Wenzhou Medical University, Lishui 323000, China)

Objective: To establish an easy, not depending on advanced laboratory apparatus method to isolate and culture rat pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs), and to explore the effects of platelet-derived growth factor (PDGF) on cell proliferation and migration. Methods: The right ventricle was perfused with the mixture of iron, agarose, and the PASMCs and iron could adhere to agarose. The iron-containing tissue would move to side of the tube next to the magnet and could be digested by collagenase I. By the method, vessel-containing tissue could be attained. With 3-4 weeks' purification, the PASMCs could be obtained. The PASMCs morphology was observed by an inverted microscope, and identified by immunocytochemistry and immunofluorescence. The effects of PDGF on cell proliferation and migration was detected by MTT assay and scratch wound assay. Results: 14 days、21 days and primary culture after isolation, the PASMCs was identified, and the result showed that isolation and primary culture of the cells were PASMCs. Compared with the cells with no stimulation, the proliferation of PASMCs exposed to PDGF was increased significantly(P<0.05), and scratch wound assay demonstrated that PDGF induced the significant increase of migration of PASMCs. Conclusion: This method to isolate and culture rat PASMCs is simple, not depending on advanced laboratory. PDGF can promote the proliferation and migration of PASMCs.

pulmonary arterial smooth muscle cells; rat; isolation; primary cell culture

2015-09-28

2016-05-16

R332

A

1000-6834(2016)04-343-05

△【通讯作者】Tel: 0578-2681018; E-mail: zengchunlai@medmail.com.cn