不同炎症状态下犬年轻恒牙牙髓干细胞增殖及成骨分化能力的改变

凌 龙，赵玉鸣，葛立宏

(北京大学口腔医学院·口腔医院，儿童口腔科 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室，北京 100081)



·论著·

不同炎症状态下犬年轻恒牙牙髓干细胞增殖及成骨分化能力的改变

凌 龙，赵玉鸣，葛立宏△

(北京大学口腔医学院·口腔医院，儿童口腔科 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室 口腔数字医学北京市重点实验室，北京 100081)

目的：探究不同炎症状态对比格犬(Beagle犬)年轻恒牙牙髓干细胞增殖及成骨能力的影响，为炎症牙髓干细胞的应用提供理论依据。方法：选取Beagle犬年轻恒前磨牙14颗，通过开髓后牙髓暴露的方法建立牙髓炎模型。对照组于开髓后立即拔髓，实验组分别于术后2周和6周拔出牙髓组织。HE染色确定牙髓炎症程度，提取不同炎症状态下牙髓组织RNA，实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)家族IL-1β、IL-6、IL-10的表达。酶消化法分离培养正常牙髓干细胞(dental pulp stem cell，DPSC)和炎症牙髓干细胞(inflammatory DPSC，IDPSC)，细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)法测定其生长曲线，并对其进行成骨分化诱导，茜素红染色，real-time PCR检测成骨相关基因骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)的表达情况。结果：开髓暴露2周和6周后，根管内仍有存活的牙髓组织，伴有不同程度的炎症细胞浸润，6周组牙髓中炎症因子高表达。各组牙髓均可分离培养出牙髓干细胞，IDPSC的增殖能力强于DPSC。经成骨诱导后实验组细胞BSP、ALP和DSPP的表达均显著高于DPSC(P<0.01)，但6周组表达显著低于2周组(P<0.01)。结论：Beagle犬年轻恒牙早期牙髓炎症状态下，牙髓干细胞的增殖和成骨分化能力均有所增强。

牙髓炎；间充质干细胞；成骨细胞；细胞增殖；细胞分化

年轻恒牙是牙根发育未完成、根尖孔未闭合的未成熟恒牙，其根管壁薄，髓腔宽大，龋齿、外伤、发育异常等因素容易造成牙髓炎症，使得牙根发育停止，影响使用寿命，因而，炎症牙髓修复再生，使牙根继续发育是临床上亟待解决的问题，也是口腔医学的研究热点。近年来，牙源性干细胞的研究为牙髓再生提供了可能性，Gronthos等[1]于2000年首次从牙髓组织分离出了牙髓干细胞(dental pulp stem cell，DPSC)，证实其具有自我更新能力，可诱导产生骨样、软骨样及脂肪样组织，体内可生成牙髓牙本质复合体，在牙髓修复再生领域有很大的应用前景。近来在炎症组织中也分离出了间充质干细胞，Alongi等[2]研究发现，炎症的牙髓组织里也含有干细胞(inflammatory DPSC，IDPSC)， 但其增殖能力及分化能力受到抑制，Park等[3]的研究结果与此类似。然而，Pereira等[4]分离炎症牙髓干细胞发现其增殖分化能力同正常细胞相近，Yu等[5]发现乳牙炎症牙髓中干细胞的增殖分化能力同正常脱落乳牙干细胞没有明显差异。目前，关于炎症对干细胞的影响尚没有统一的结论，且没有对年轻恒牙牙髓炎的相关研究。本实验拟通过建立比格犬(Beagle犬)年轻恒牙不同炎症程度牙髓炎模型，观察不同炎症状态下年轻恒牙DPSC增殖及成骨分化能力的改变，为炎症状态下DPSC介导组织修复再生提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由北京玛斯生物技术有限公司提供雄性Beagle犬，20周龄，遗传背景清楚明确，饲养于北京大学口腔医院动物房，饲养级别为清洁级。本研究通过北京大学生物医学伦理委员会审查，批号为LA2011-045。

1.2 建立牙髓炎模型

使用3%(质量分数)戊巴比妥钠按1 mL/kg体重剂量静脉注射于20周Beagle犬进行麻醉，采用分角线投照技术拍摄双侧上、下颌前磨牙根尖片，确认牙根发育程度，选取14颗前磨牙的21个牙根进行开髓实验，开髓洞型为直径2 mm圆形，牙髓暴露制造牙髓炎症。分别于术后即刻、2周、6周用拔髓针取出牙髓，以术后即刻牙髓为对照组。取样完成后对实验牙齿进行根管治疗后树脂充填。

1.3 HE染色

牙髓取样后用4%(质量分数)多聚甲醛固定，石蜡包埋，制备5 μm切片，脱蜡入水，苏木素染色，盐酸酒精粉色，氨水返蓝，伊红染色，梯度酒精脱水，中性树胶封片，光镜下观察组织形态学变化及炎症细胞的浸润。

1.4 实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测牙髓炎症因子表达

牙髓取样后液氮保存，取样完成后取出，无菌小镊子剪碎，加入1 mL Trizol，超声组织破碎仪裂解组织，Trizol试剂盒提取总RNA，采用Superscript Ⅲ逆转录酶合成cDNA模板，real-time PCR检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)家族(IL-1β、IL-6、IL-10)的表达，引物序列见表1。反应体系(20 μL)：H2O 8 μL，SYBR 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。反应参数：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 10 s，退火64 ℃ 30 s，35个循环，最后一个循环结束后做溶解曲线。

1.5 细胞培养

每组3个牙根(来自于3颗不同的前磨牙)的牙髓用于细胞培养。将取出的牙髓组织立即在含双抗(链霉素-青霉素)的D-Hanks液中浸泡冲洗3次，转移至60 mm培养皿，加入1 mL的3 g/LⅠ型胶原酶(美国Sigma公司)和4 g/L Dispase酶(美国Sigma公司)，无菌小弯剪充分剪碎，转移至15 mL离心管，37 ℃震荡消化45 min，加入等体积培养基中止消化，1 200 r/min离心5 min，去上清，1 mL培养基重悬，接种于60 mm培养皿，细胞培养基为10%(质量分数)胎牛血清(美国Hyclone公司)、1%(质量分数)双抗和αMEM培养基。于37 ℃、5%(体积分数)CO2孵箱中培养，每隔2～3 d换液1次，待细胞生长汇合，消化收集细胞，传代培养。

1.6 Beagle犬DPSC增殖能力及成骨能力研究

细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)法检测细胞的增殖能力：将P2代细胞以5×103/孔的密度接种于96孔板，每组3个复孔，于37 ℃、5% (体积分数)CO2培养。分别于1、3、5、7、9、10 d更换培养基，避光加入10 μL CCK-8(日本同仁研究所)，37 ℃孵箱孵育3 h后将96孔板置于酶标仪(BioTek，ELX808)内测定各孔光密度值(D450 nm)，实验重复3次。以细胞接种和检测天数为横坐标，D值为纵坐标绘制Beagle犬生长曲线。

成骨分化：P2代细胞以5×104/孔的密度接种于6孔板，培养至80%汇合后，成骨诱导组更换成骨诱导培养液[αMEM、10%(质量分数)FBS、10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油钠、50 mg/L抗坏血酸钠]进行培养，对照组继续加入细胞培养液，每3天换液，3周后终止培养。

茜素红染色：成骨诱导结束后细胞用4%(质量分数)多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，2%(质量分数)茜素红(Sigma公司)染色15 min，PBS漂洗3次，肉眼及镜下观察。

Real-time PCR检测骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)表达：细胞成骨诱导终止后，Trizol试剂盒提取总RNA，采用Superscript Ⅲ逆转录酶合成cDNA模板，引物序列见表1。

表1 基因和引物序列Table 1 Specific primers for real-time reverse transcription-PCR

BSP, bone sialoprotein;ALP, alkaline phosphatase;DSPP, dentin sialophosphoprotein;TNF-α, tumor necrosis factor α;IL-1β, interleukin-1β;IL-6, interleukin-6;IL-10, interleukin-10;GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

1.7 Real-time PCR结果分析

采用2-ΔΔCt法进行数据分析：(1)Real-time PCR测得实验组和对照组中每个样本的Ct值，即扩增时荧光信号达到固定阈值时的循环次数；(2)计算对照组和实验组中各目的基因相对于内参基因的ΔCt值，即：ΔCt(对照组)=目的基因Ct平均值-内参基因Ct平均值，ΔCt(实验组)=目的基因Ct平均值-内参基因Ct平均值；(3)计算实验组每个基因相对于对照组的ΔΔCt值，即：ΔΔCt=ΔCt(实验组)-ΔCt(对照组)；(4)计算2-ΔΔCt，得出目的基因的相对表达量(实验组相对于对照组)，即相对定量值。每组设计3个重复孔。

1.8 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。Real-time PCR及细胞增殖能力结果采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法，P<0.05即认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Beagle犬年轻恒牙牙髓炎症模型的建立

实验用Beagle犬年轻恒前磨牙根尖X线片示牙根发育为Nolla 8～9期，属于年轻恒牙，实验牙取样前拍根尖X线片，根尖周未见明显病变。对照组牙髓拔髓形态完整，质地坚韧；2周炎症组可见露髓处牙髓色暗红，探出血明显，质地较韧；6周炎症组可见牙髓增生凸出开髓孔外，呈肉芽状。HE染色可见对照组牙髓内胶原纤维呈条索状排列，并有大量梭形成纤维细胞，细胞核均为成纤维状，组织结构整齐；2周炎症组的牙髓内仍可见条索状胶原纤维和成纤维细胞，但有大量胞核小而圆、核深染的炎症细胞弥漫性浸润，并可见到散在的炎症细胞浸润灶；6周炎症组的牙髓中冠髓结构紊乱，炎症细胞浸润，破坏了正常的组织排列结构，根尖部大量核深染的炎症细胞聚集(图1)。

2.2 炎症牙髓组织中炎症因子表达

提取不同炎症时期牙髓组织RNA，real-time PCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的表达，结果如图2所示，TNF-α表达在2周与6周炎症组明显高于对照组(P<0.05)，而IL-1β、IL-6、IL-10在2周炎症组牙髓中的表达与对照组差异无统计学意义，在6周炎症组牙髓中的表达则显著高于对照组(P<0.001)。

2.3 DPSC与IDPSC的分离培养

酶消化法获得的Beagle犬DPSC与IDPSC形态相似，均为典型的成纤维细胞形态(图3)。细胞可以稳定传代，传至5～6代形态均未明显改变，选用2～3代的细胞进行下一步实验。

2.4 增殖能力检测

通过CCK-8法检测细胞的生长能力，绘制生长曲线，可见实验组与对照组细胞均经历了潜伏期、快速生长期、平台期和退化衰亡期，IDPSC的整体增殖速率快于DPSC，6周炎症组IDPSC在7、9、10 d的光密度值与DPSC相比差异有统计学意义，而2周炎症组IDPSC在9、10 d的光密度值与DPSC相比差异有统计学意义(P<0.01，图4)。

2.5 成骨能力检测

经成骨诱导茜素红染色后DPSC与IDPSC均可见红色矿化结节(图5箭头所示)，real-time PCR 检测成骨相关基因的表达结果显示，2周和6周炎症组的细胞成骨相关基因BSP、DSPP、ALP表达均高于对照组细胞，差异有统计学意义(P<0.01)，且6周时基因的表达与2周相比有明显降低(P<0.01，图6)。

A & a, normal dental pulp as control (the arrows show the fibroblasts); B & b, pulp exposed for 2 weeks with large numbers of inflammatory cells infiltration (the arrow shows the focal inflammatory cells infiltration);C & c,the coronal pulp exposed for 6 weeks, without normal structure, with infiltration by a large number of inflammatory cells (the arrows show the lymphocytes);D & d,the apex of pulp exposed for 6 weeks, with necrosis of normal tissue which replaced by inflammatory cells.

图1 不同炎症时期牙髓HE染色(A～D，×4；a～d，×40)
Figure 1 HE staining of dental pulp under different inflammatory stage (A-D, ×4; a-d, ×40)

RQ, relative quantification. *P<0.05 vs.0 week (control group).

图2 不同炎症时期牙髓组织炎症因子表达
Figure 2 The expression of cytokines in dental pulp from different inflammation period

A, DPSCs from normal dental pulp; B, IDPSC from dental pulp exposed for 2 weeks; C, IDPSCs from dental pulp exposed for 6 weeks.

图3 不同炎症时期原代牙髓细胞形态(×4)
Figure 3 Cell morphology of stem cells form different inflammation period (×4)

图4 不同炎症时期犬牙髓细胞生长曲线
Figure 4 The growth curve of cells from different inflammation period

3 讨论

年轻恒牙不可逆性牙髓炎的治疗一直是临床上的难题，无论是再血管化治疗还是根尖诱导成形术都只能封闭根尖孔，使牙根有一定的增长，但不能恢复牙髓活性，使牙根有正常的生物学性能。自2000年Gronthos等[1]从牙髓组织分离出DPSC后，牙源性干细胞的多向分化潜能给牙髓修复再生提供了希望，但其细胞来源有限，因此，学者们尝试寻找其他更容易获得的干细胞来源。Alongi等[2]研究发现，炎症的牙髓组织里也含有间充质干细胞，可以在体内形成牙髓-牙本质复合体，预示着这类细胞在修复再生医学方面有很大的应用前景，或许会改变年轻恒牙不可逆性牙髓炎的治疗方式。

关于牙髓炎症的研究大多基于动物实验，有研究报道暴露小鼠牙齿牙髓制造根尖周炎模型，结果观察到60 d时根尖区仍有存活牙髓，90 d时牙髓全部坏死[6]。Gullberg等[7]的实验将Beagle犬成熟恒牙去除全部冠髓使牙髓暴露，14 d时观察到牙髓全部坏死。本实验通过对Beagle犬年轻恒牙进行开髓、暴露不同时间的方法，成功建立了不同炎症状态的年轻恒牙牙髓炎模型。实验中暴露2周的牙髓，HE染色可见大量的淋巴细胞浸润，牙髓组织结构清楚，属于牙髓早期阶段；暴露6周的牙髓，HE染色可见冠髓组织结构紊乱，正常细胞被炎症细胞取代，且在根尖区发生了组织坏死，表明牙髓炎症已进入中晚期阶段。

A, DPSC; B, IDPSC from 2 weeks inflamed pulp; C, IDPSC from 6 weeks inflamed pulp.The arrows show mineralized nodules.

图5 牙髓细胞成骨诱导后茜素红染色(×4)
Figure 5 Alizarin red staining after cells cultured in osteogenesis media (×4)

与既往研究不同，本实验牙髓暴露6周后仍有存活的牙髓，其原因一方面是由于选用的牙齿为年轻恒牙，根尖发育未完成，血运丰富，抗炎能力强；另一方面是实验中开髓洞型较小，且保留了冠髓，所形成的牙髓炎模型更接近临床实际情况。

本研究中炎症因子的检测结果显示，2周组牙髓炎症因子与正常牙髓差异不大，说明犬牙髓抗炎能力较强，尚处于炎症初期；而6周组牙髓炎症因子表达显著高于对照组及2周组，说明炎症随牙髓暴露时间增加而加重。TNF-α是炎症过程中最重要的细胞因子，在炎症过程中可以引起血管扩张、透明以及白细胞的趋化，造成吞噬细胞的增多和内毒素的释放进而加重炎症反应，它的含量代表了炎症的严重程度。IL-6为炎症促进因子，IL-10为炎症负向调节因子，6周组牙髓IL-6与IL-10的高表达提示炎症进入中后期，机体启动了炎症调控机制。

RQ, relative quantification. Other abbreviations as in Table 1. *P<0.01 vs.0 week (control group); # P<0.01 vs.6 weeks inflamed pulp.

图6 牙髓细胞成骨诱导后相关基因的表达
Figure 6 The expression of genes after osteoblastic induction

实验中分离培养了炎症牙髓以及正常牙髓干细胞，从形态学上观察两者细胞形态相似，说明炎症并未在形态上对细胞有所影响。既往有些研究表明炎症会抑制干细胞的增殖[2, 8-9]，有些则认为炎症状态下干细胞的增殖不受影响[3-5]，本实验比较了DPSC与IDPSC的增殖能力，发现IDPSC的生长能力均略强于DPSC，表明炎症刺激在一定程度上增强了牙髓干细胞的增殖能力。同时，Park等[3]观察到炎症状态下牙周膜干细胞的迁移能力增强，已有研究发现缺氧环境下DPSC的增殖能力和成血管能力增强[10-11]，且不可逆牙髓炎中TGF-β1的表达上调，TGF-β1可促进细胞增殖和分化[12]，这或许为炎症环境下细胞的增殖能力不受影响甚至增强提供了理论依据。关于炎症对干细胞增殖的影响，目前尚无统一结论，可能为各个实验中炎症状态不同所致。本实验选用的是年轻恒牙，年轻恒牙血运丰富，细胞增殖能力强，可能对炎症刺激的反应也较强；另外，本实验的取样动物为Beagle犬，种属不同也可能是实验结果不同的原因。

对DPSC与IDPSC进行成骨诱导均可形成大量矿化结节，real-time PCR检测成骨相关基因的表达，发现2周组与6周组细胞的表达均显著高于正常细胞，另外2周组基因表达也显著高于6周组，即炎症早期IDPSC的成骨能力显著增强，晚期有所下降，说明早期轻度炎症刺激可增强IDPSC的成骨分化能力，而随着时间延长炎症程度加重，细胞的成骨能力下降。Goldberg等[13]研究发现，轻度炎症会促进细胞的成骨分化，但重度炎症会导致细胞凋亡，与本研究结果一致。也有研究结果显示,炎症组织干细胞成骨分化能力与正常组织无明显差异[4-5,8-9]或者低于正常组织[2-3]，这可能是在炎症的不同阶段取样所致。

本实验通过开髓使牙髓暴露于不同时间的方法建立了Beagle犬年轻恒牙不同严重程度的牙髓炎模型，证明炎症环境下牙髓干细胞的增殖能力有所增加，炎症早期牙髓干细胞的成骨分化能力明显增强，后期有所下降，提示临床上年轻恒牙不可逆牙髓炎中牙髓干细胞用于修复再生治疗的可能性。虽然早期炎症牙髓干细胞的增殖及成骨能力有所增强，但关于炎症环境对干细胞凋亡及免疫学特性的影响目前尚不明确，有待于进一步实验探究。

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(2015-01-20收稿)

(本文编辑：赵 波)

Impact of different degree pulpitis on cell proliferation and osteoblastic differentiation of dental pulp stem cell in Beagle immature premolars

LING Long, ZHAO Yu-ming, GE Li-hong△

(Department of Pediatric Dentistry, Peking University School and Hospital of Stomatology & National Engineering Laboratory for Digital and Material Technology of Stomatology & Beijing Key Laboratory of Digital Stomatology, Beijing 100081, China)

Objective：To compare the proliferation and osteoblastic differentiation of dental pulp stem cell (DPSC) isolated from normal and inflamed pulps of different degrees in Beagle immature premolars, and provide evidence for the use of inflammatory DPSC (IDPSC). Methods: This study evaluated 14 Beagle’s young premolars (21 roots). In the experiment group, irreversible pulpitis was induced by pulp exposure and the inflamed pulps were extracted 2 weeks and 6 weeks after the pulp chamber opening.For the control group, normal pulps were extracted immediately after the exposure. HE staining and real-time PCR were performed to confirm the inflammation. The cells were isolated from the inflamed and normal pulps (IDPSC and DPSC). Cell proliferation and osteoblastic differentiation potentials of the two cells were compared. Results: Inflammation cells infiltration was observed in the inflamed pulps by HE staining. The expression of inflammatory factor was much higher in the 6 week inflamed pulp. IDPSC had higher potential of cell proliferation and osteoblastic differentiation potentials. Furthermore, the osteoblastic differentiation potentials of IDPSC from 2 week inflamed pulp were higher than those from 6 week inflamed pulp. Conclusion: The potential of cell proliferation and osteoblastic differentiation of DPSC was enhanced at early stage of irreversible pulpitis, and reduced at late stage in Beagle immature premolars.

Pulpitis; Mesenchymal stromal cells; Osteoblasts; Cell proliferation; Cell differentiation

时间：2015-5-27 11：18：51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20150527.1118.021.html

R781.33

A

1671-167X(2016)05-0878-06

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.05.024

△ Corresponding author’s e-mail, gelh0919@126.com