UHPLC-MS/MS法测定雷公藤甲素人血浆蛋白结合率

柏小辉 潘荣华 芮国华 赵艳美 杨旭东

江苏省溧阳市中医院肾脏内科，江苏溧阳213300

UHPLC-MS/MS法测定雷公藤甲素人血浆蛋白结合率

柏小辉 潘荣华 芮国华 赵艳美 杨旭东

江苏省溧阳市中医院肾脏内科，江苏溧阳213300

目的研究雷公藤甲素在人血浆中的蛋白结合率。方法采用UHPLC-MS/MS法测定透析内液及外液中雷公藤甲素浓度，同时估算其与人血浆的蛋白结合率。结果雷公藤甲素的线性关系、精密度与准确度、提取回收率和稳定性均符合方法学要求。实验结果表明，雷公藤甲素低、中、高（0.8、0.4、0.2 μg/mL）3个浓度中，雷公藤甲素的人血浆蛋白结合率分别为（88.61±1.45）%、（89.28±2.64）%、（88.67±1.59）%。结论雷公藤甲素与人血浆具有高强度蛋白结合率。

雷公藤甲素；血浆蛋白结合率；平衡透析法；超高效液相串联质谱

雷公藤甲素（Tripto1ide）为卫矛科木质藤本植物雷公藤（Tripterygium wi1fordii）中分离得到的环氧化二萜内酯类成分，是雷公藤中的活性成分之一［1-3］。现代药理学研究表明，雷公藤甲素具有一系列药理活性，如抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等药理作用［4-7］，其中其显著的抗肿瘤活性越来越得到临床的认可，是潜在的抗肿瘤候选药物。但是，雷公藤甲素治疗窗十分小，同时，在临床治疗中常常出现多种不良反应。另外，有研究表明，雷公藤甲素不仅是雷公藤制剂的有效成分而且也是有毒成分［8-10］。

药物血浆蛋白结合率是药动学主要参数之一，和药物的疗效有重要的关系。通过查阅相关文献，未见雷公藤甲素有关血浆蛋白结合率的报道。本试验采用平衡透析法研究雷公藤甲素在人血浆蛋白中的结合率，并建立UHPLC-MS/MS法测定雷公藤甲素在人血浆中的浓度，为进一步开展药代动力学研究提供借鉴。

1 仪器与材料

Agi1ent G6430 LC-MS/MS液质联用仪（美国Agi 1ent公司，所配高效液相仪为Agi1ent 1290）；MassHunter数据处理系统（version B.05.00）；CentriVap离心浓缩仪（美国照生公司）；WH-2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）；Maxima超纯水机（美国基因公司）；Biofuge PrimoR冷冻高速离心机（德国Heraeus公司）；透析袋（美国联合碳化公司，14000 D，压平宽度25 mm）；病毒灭活冰冻人血浆（江苏省血液中心）。

对照品雷公藤甲素（批号111567-201404，中国食品药品检定研究院）、泼尼松龙（批号100153-201405，中国食品药品检定研究院）；实验用水为哇哈哈纯净水。

2 方法

2.1 色谱质谱条件

Phenomenex Gemini C18色谱柱（3 μm，100 mm× 2.0 mm）；流动相：甲醇-0.1%冰醋酸水溶液（含2 mmo1/L醋酸铵）=75∶25；流速：200 μL/min；柱温：35℃；进样体积：2 μL。离子源：电喷雾电离源（ESI）；正离子方式检测；定量模式：多反应监测（MRM）；干燥气温度：400℃；毛细管电压：4000 V；雷公藤甲素的裂解电压（Fragmentor）及碰撞电压（CE）值分别为90、5 V；泼尼松龙（内标）的Fragmentor及CE值分别为100、20 V。检测对象：雷公藤甲素m/z 378.2→m/z 361.1；内标m/z 361.3→m/z 147.0。

2.2 溶液的配制

2.2.1 空白PBS溶液制备精密称定2.70gKH2PO4、18.31 g K2HPO4·3H2O、11.18 g KC1，置于1 L容量瓶中，超纯水稀释并定容至1 L，得pH=7.4的PBS溶液［11-12］。

2.2.2 制备对照品储备液精密称定雷公藤甲素10.12mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，超声10 min，摇匀，即得浓度为1012 μg/mL雷公藤甲素储备液；精密称定泼尼松龙10.04 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，超声10 min，摇匀，即得浓度为1004 μg/mL内标储备液。

2.2.3 制备透析外液分别精密称定雷公藤甲素8、4、2 mg，加入适量PBS溶液溶于1 L容量瓶，超声30 min，PBS溶液定容至刻度，摇匀，分别取上述溶液适量，用PBS溶液稀释10倍，即得浓度为0.8、0.4、0.2 μg/mL的透析外液。

2.3 样品处理

2.3.1 透析内液渊血浆冤吸取100 μL透析内液样品，加入浓度为1 μg/mL内标泼尼松龙10 μL，震荡30 s，加入萃取溶剂乙酸乙酯1.5 mL，震荡5 min，12000 r/min离心5 min，移出上清液。30℃下氮气吹干，100 μL 75%甲醇复溶，震荡5 min，12 000 r/min离心5 min，2 μL上清液进行LC-MS分析。

2.3.2 透析外液渊PBS冤吸取透析外液100 μL，按“2.3.1”项下操作流程处理。

2.4 平衡透析试验

透析袋预处理后备用，将其中一端扎紧，并加入1 mL空白人血浆，扎紧透析袋的另一端，同时袋内保留部分空气，将扎好的透析袋置于装有30 mL含雷公藤甲素PBS溶液的带盖玻璃瓶中，调节透析袋的位置，保证袋内血浆与袋外PBS溶液液面一致，保证透析袋不接触瓶壁，将玻璃瓶放入4℃冰箱中。当透析袋内外液药物扩散平衡后，透析实验即结束，实验结束后使用10%高氯酸溶液检测袋外PBS溶液，验证袋内血浆蛋白是否漏出。

图1 雷公藤甲素及内标色谱图

3 结果

3.1 专属性

在本实验检测方法下，雷公藤甲素和内标的保留时间分别约为1.17、1.12 min，未发现有其他物质干扰检测，见图1。

3.2 线性关系

3.2.1 透析内液样品标准曲线用甲醇溶液对雷公藤甲素储备液进行稀释，制备7个浓度梯度的系列工作液。分取雷公藤甲素工作液10 μL，加入空白血浆100 μL，按“2.3.1”项下方法进行处理，取2 μL上清液直接进样。以雷公藤甲素峰面积与内标峰面积比值（Y）对血药浓度（X）作图，求得回归方程。结果见表1。表明雷公藤甲素在1～512 ng/mL浓度范围内线性关系良好。

3.2.2 透析外液样品标准曲线按“3.2.1”项下方法配制7个不同浓度的雷公藤甲素工作液，分别吸取雷公藤甲素工作液和内标工作液各10 μL，N2吹干，精密吸取空白PBS缓冲溶液100 μL，按“2.3.2”项下操作流程进行，取2 μL上清液进LC-MS分析。以雷公藤甲素的峰面积与内标峰面积比值（Y）对透析外液浓度（X）作图，求得回归方程，结果见表1，表明雷公藤甲素在0.2～51.2 ng/mL浓度范围内线性关系良好。

表1 雷公藤甲素标准曲线

3.3 准确度和精密度

按“3.2”项下方法配制低、中、高3个浓度的雷公藤甲素QC样品（透析内液QC样品浓度为2、64、384ng/mL。透析外液QC样品浓度为0.4、12.8、38.4 ng/mL），考察准确度和精密度，结果见表2。雷公藤甲素日内精密度RSD小于8.34%，符合生物样品分析要求。

3.4 提取回收率

制备“3.3”项下低、中、高3个浓度的模拟血浆（透析外液）样品；每个浓度平行5份；另取空白人血浆（空白透析外液）处理用于制备未经提取含雷公藤甲素的透析内液、外液样品；精密吸取1 mL乙酸乙酯，置于100 μL空白人血浆（空白PBS溶液）中，振荡3 min，12000 r/min离心10 min，吸取上清液，室温N2吹干，精密吸取低、中、高3个浓度的雷公藤甲素质控样品10 μL、内标工作液10 μL以及75%甲醇80 μL，振荡5 min，12 000 r/min离心5 min，取2 μL上清液进LC-MS分析，记录雷公藤甲素的峰面积，计算提取回收率，结果见表2。实验结果符合生物样品分析方法的要求。

表2 雷公藤甲素基质效应、回收率、准确度与精密度结果（n=5）

3.5 基质效应

取1.5 mL EP管若干，分别加入10 μL低、中、高3个浓度的雷公藤甲素QC样品及内标10 μL，复溶液75%甲醇80 μL，振荡3 min，取2 μL进行LC-MS分析，记录峰面积A1。除不加内标外，另按“2.3”项下操作流程制备空白血浆或空白PBS若干，N2吹干后同上操作，记录峰面积A2。基质效应等于A1与A2的比值。结果见表2。实验结果符合生物样品分析方法的要求。

3.6 稳定性

考察低、中、高3个浓度的含有雷公藤甲素的透析内、外液样品置于室温环境下静置0、4 h，在进样室中放置待测样品12 h及4℃放置12、24 h，考察其稳定性。以线性回归方程进行测定，各个浓度样品RSD均小于4.28%，结果表明雷公藤甲素在室温4 h、4℃放置24 h及进样室放置样品12 h均稳定。

3.7 平衡时间考察

用空白PBS代替人血浆置于透析袋内，按“2.4”项下方法进行实验，分别于8、12、24、48 h结束实验并考察平衡时间。结果表明雷公藤甲素在12 h内外液浓度达到平衡。

3.8 血浆蛋白结合率

血浆蛋白结合率（%）=（透析内液浓度-透析外液浓度）/透析内液浓度×100%。按照以上公式计算雷公藤甲素的血浆蛋白结合率，结果见表3。

表3 雷公藤甲素在人血浆中蛋白结合率（n=3）

4 讨论

雷公藤甲素是雷公藤制剂中抗肿瘤、抗炎、免疫抑制的重要活性物质，但同时也是毒性物质。雷公藤相关制剂的确切疗效已经得到了临床的充分认可，同时其治疗窗十分狭窄的不足之处也相当明显，在临床治疗中常常出现多种不良反应。本实验建立UHPLC/MS/MS联合平衡透析法测定雷公藤甲素的人血浆蛋白结合率，实验结果表明，雷公藤甲素在人血浆中属于高结合型药物，雷公藤甲素的浓度与其蛋白结合率没有相关性，该结果为临床合理使用雷公藤相关制剂提供数据支持。

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Determination of the Protein-binding rate of triPtolide with human Plasma by UHPLC-MS/MS

BAI XiaohuiPAN RonghuaRUI GuohuaZHAO YanmeiYANG Xudong
Department of Nephro1ogy，Liyang Hospita1 of TCM，Jiangsu Province，Liyang213300，China

Objective To study the protein-binding rate of tripto1ide with human p1asma.Methods A UHPLC-MS/MS method was carried to determine the protein-binding rate in vitro.A UHPLC-MS/MS method for the determination of tripto1ide both in inner and outer dia1ysis was estab1ished and then the protein-binding rate with human p1asma was ca1cu1ated.Results Linear re1ationship，precision and accuracy，extraction recovery and stabi1ity of tripto1ide a11 comp1ied with the methodo1ogy requirements.Within the high，midd1e and 1ow concentration（0.8，0.4，0.2 μg/mL）of tripto1ide，the protein-binding rates of tripto1ide were（88.61±1.45）%，（89.28±2.64）%and（88.67±1.59）%，respective1y.Conclusion Tripto1ide has high capacity in binding to human p1asma protein in vitro.

Tripto1ide；Protein-binding rate；Equi1ibrium dia1ysis method；UHPLC-MS/MS

R917

A

1673-7210（2016）07（c）-0046-04

2016-02-05本文编辑：赵鲁枫）

江苏省中医药局科技项目（LZ11144）。

潘荣华（1964-），男，主任医师，主要从事临床肾科工作。