颈部不良应力对大鼠脊髓组织诱导型一氧化氮合酶表达影响的实验研究

沈录峰 张遂辉 董谢平 杜晓梅 孙艳群

1.江西省人民医院康复医学科，江西南昌330006；2.江西中医药大学，江西南昌330025；3.江西省人民医院骨科，江西南昌330006；4.江西省人民医院干部保健门诊，江西南昌330006

颈部不良应力对大鼠脊髓组织诱导型一氧化氮合酶表达影响的实验研究

沈录峰1张遂辉2董谢平3杜晓梅1孙艳群4

1.江西省人民医院康复医学科，江西南昌330006；2.江西中医药大学，江西南昌330025；3.江西省人民医院骨科，江西南昌330006；4.江西省人民医院干部保健门诊，江西南昌330006

目的探讨颈部应力不良对大鼠脊髓组织诱导型一氧化氮合酶表达（iNOS mRNA）的影响。方法选择SD大鼠60只，随机分为4组，对照组（A组，6只）：不做任何处理；假手术组（B组，18只）：切开皮肤，不损伤肌群；后深肌群损伤组（C组，18只）：切断部分颈部深肌群；后浅肌群损伤组（D组，18只）：切断部分颈部浅肌群。分别于术后1、3、6个月动态观察大鼠血清中IL-6、NO水平及颈部脊髓组织中iNOS mRNA表达及NOS活性的变化。结果①IL-6水平：与A组比较，C组术后3、6个月及D组术后6个月IL-6水平明显升高（P＜0.05）；与B组比较，C组与D组术后6个月IL-6水平均明显较高（P＜0.05）。②NO水平：与A、B组比较，D组和C组术后6个月血清NO水平显著升高（P＜0.05）。③iNOS mRNA：A、B组中未测得iNOS mRNA表达，C组及D组术后3、6个月iNOS mRNA表达显著升高（P＜0.05）。④NOS活性：术后1个月，C组NOS活性较A、B组显著升高（P＜0.01），D组NOS活性较A组显著升高（P＜0.05）；术后3、6个月，C、D组NOS活性较A、B组差异明显（P＜0.05）。结论颈部不良应力可引起颈脊髓慢性损伤。

颈部应力不良；诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮；基因表达

对于颈椎病的病因学研究，国内外学者认为主要以颈椎间盘退变为基础［1-2］，但近年来，颈部肌肉的作用越来越受到学者的关注［3-7］。研究显示，颈椎周围肌群是维系颈椎关节稳定和功能的动力系统，在颈推病发生发展中发挥了重要作用［8-9］。一氧化氮及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在中枢神经系统慢性损伤中发挥着不容忽视的作用［10-11］。本研究基于以上研究基础，通过建立颈部应力不良的SD大鼠实验模型，动态观察颈部应力不良后颈脊髓组织中iNOS的变化，探讨肌肉力量不平衡在颈椎病发病中的机制，进一步为颈椎病的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及造模

健康成年SD大鼠60只（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号：43004700015），体重280～300 g，随机分为4组，对照组（A组，6只）：不做任何处理，作为参照；假手术组（B组，18只）：切开皮肤，不损伤肌群；后深肌群损伤组（C组，18只）：切断部分颈部夹肌、最长肌、颈髂肋肌、头半棘肌；后浅肌群损伤组（D组，18只）：切断部分颈斜方肌、头颈菱形肌。操作均在无菌条件下进行，术后给予青霉素40万单位肌注，2次/d，连续3 d，给予普通饲料饮食，分笼饲养［12］。

1.2 主要试剂

白介素-6（IL-6）、一氧化氮（NO）ELISA试剂盒由上海西唐生物技术有限公司提供；E.Z.N.A.总RNA提取试剂盒（Omega）、SuperQuickRT cDNA第一链合成试剂盒以及2×Es Taq MasterMix（含染料）均为北京康为世纪生物科技有限公司生产；琼脂糖为西班牙BIOWEST公司生产；三氯甲烷、异丙醇等有机溶剂均为分析纯，由国药化学试剂有限公司生产；一氧化氮合酶（NOS）活性检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 标本采集

分别于造模后1、3、6个月处死大鼠，处死前大鼠眼眶取血，分离血清，液氮速冻后做好标记，-70℃下保存。剪下颈椎，采集脊髓标本约100 mg放置冻存管中，做好标记，液氮速冻后转存于-70℃冰箱。

1.4 IL-6、NO含量测定

采用ELISA法测定血清IL-6、NO含量，均根据试剂盒说明操作。

1.5 iNOS mRNA检测

1.5.1 引物合成PCR扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的引物采用PAGE法进行纯化。GAPDH引物扩增产物条带大小为148 bp，iNOS引物扩增产物条带大小为398 bp。引物如下：GAPDH：P15'-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，P25'-GACTCCACGACATACTCAGCA-3'；iNOS：P15'-CA CAGTCTTGGTGAAAGCG-3'，P25'-GGTGAGACAG TTTCTGGTCG-3'。

1.5.2 组织总RNA提取及纯度鉴定［13］从超低温冰箱中取出标本15 mg左右于碾砵中，剪刀剪碎，并加入液氮碾磨，充分碾磨后加入700 μL含有2%巯基乙醇的TRK溶液，震荡裂解细胞；把裂解液加到RNA Homogenizer离心柱中，高速离心2 min，收集匀浆液，并加入同体积的70%乙醇；将以上混合液加入到HiBind RNA Mini柱中，离心1 min，去滤液；离心后弃上清，加入500 μL RNA Wash BufferⅠ至HiBind RNA Mini柱中，离心30 s；离心后弃上清，加入500 μL RNA Wash BufferⅡ至HiBind RNA Mini柱中，离心1 min；重复以上RNA Wash BufferⅡ清洗步骤；HiBind RNA Mini柱高速离心2 min，室温下放置2 min使得柱子残留酒精挥发完全；将HiBind RNA Mini放置于1.5 mL离心管中，并加入50 μL DEPC水，室温放置2 min，高速离心2 min，收集到的RNA溶液保存于-70°C。应用微量核酸蛋白测定仪测定从各标本中提取RNA的OD260/OD280值，并计算RNA溶液浓度，将比值在1.8～2.0之间的标本进行逆转录反应。

1.5.3 逆转录渊RT冤反应按照康为世纪公司生产的SuperQuickRT cDNA第一链合成试剂盒说明书进行逆转录反应，采用20 μL反应体系：5×RT Buffer 4 μL，dNTP Mix 4 μL，Primer Mix 1 μL，SuperQuickRT Mix 1 μL，RNA 2μL，无RNase水8 μL。反应条件为：42°C孵育30 min，85°C孵育5 min。反应结束短暂离心后置于冰上冷却，-20°C保存。

1.5.4 多聚合酶链渊PCR冤反应按照2×Es Taq Master-Mix产品说明书进行PCR反应，采用20 μL反应体系：2×Es Taq MasterMix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，双蒸水6 μL。反应步骤为：95°C孵育10 min，95°C孵育30 s，58°C孵育30 s，72℃延伸30 s，扩增35个循环，扩增完成后72°C孵育10 min；4°C保存。

1.5.5 琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像制备2%浓度的琼脂糖凝胶（含溴化乙锭），将PCR产物和DNA Marker直接上样至琼脂糖凝胶中，120 V稳压电泳40 min后用BIO-RAD凝胶成像系统拍照，并用Image J软件进行灰度值测定。

1.6 NOS活性检测

严格按照试剂盒所提供试剂及操作方法进行。

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 颈部应力不良对大鼠血清IL-6水平影响

大鼠血清IL-6水平检测结果表明：随造模时间延长，C组及D组血清IL-6水平逐渐增高，其中，与A组比较，C组3术后3、6个月，D组术后6个月血清IL-6水平明显升高（P＜0.05）；与B组比较，C、D组术后6个月血清IL-6水平明显升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠不同时间血清IL-6水平比较（pg/mL，）

表1 各组大鼠不同时间血清IL-6水平比较（pg/mL，）

注：与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较，△P＜0.05；“-”表示未检测

组别只数术后1个月术后3个月术后6个月A组B组C组D组6 --18 18 18 77.2±11.2 93.9±17.1 128.3±9.8 101.3±10.4 88.3±13.2 150.4±16.7*126.9±13.5 79.7±9.4 194.5±25.4**Δ160.2±20.3*Δ

2.2 颈部应力不良对大鼠血清中NO水平的影响

大鼠血清NO水平检测结果表明：随造模时间延长，C组及D组血清NO水平增高，其中，与A组及B组比较，术后6个月C组、D组血清NO水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠不同时间血清NO水平比较（μmo1/L，）

表2 各组大鼠不同时间血清NO水平比较（μmo1/L，）

注：与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；“-”表示未检测

组别只数术后1个月术后3个月术后6个月A组B组C组D组6 --18 18 18 3.55±1.25 3.92±1.13 4.11±1.37 3.98±0.87 3.41±0.97 4.79±1.23 4.62±1.41 3.63±1.45 6.22±1.47**ΔΔ5.03±1.25*Δ

2.3 颈部应力不良对大鼠脊髓不同时段iNOS mRNA表达的影响

结果显示，iNOS mRNA于A组和B组中未测得表达，C组及D组造模后1、3、6个月iNOS mRNA的表达逐渐增加，其中，与A组及B组比较，C组及D组术后3、6个月iNOS mRNA表达显著升高（P＜0.05）。见表3、图1～2。

表3 各组大鼠不同时间脊髓iNOS mRNA表达比较（）

表3 各组大鼠不同时间脊髓iNOS mRNA表达比较（）

注：与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；“-”表示未检测

组别只数术后1个月术后3个月术后6个月A组B组C组D组6 18 18 18 0 0 -0 -0 0.61±0.02 0.54±0.02 0.82±0.04*Δ0.76±0.05*Δ1.21±0.06**ΔΔ0.93±0.04*Δ

图1 GAPDH的RT-PCR产物检测情况

图2 各组不同时间段iNOS mRNA的RT-PCR产物检测情况

2.4 颈部应力不良对大鼠脊髓不同时段NOS活性的影响

实验发现，造模1个月后，A组脊髓组织NOS的活性较B组基本无变化，C组NOS活性达到峰值，较A组及B组显著升高（P＜0.01），D组NOS活性较A组显著升高（P＜0.05）。造模3个月后，B组NOS活性有所降低，但与A组比较差异无统计学意义（P＞0.05），C组NOS活性略有下降，仍明显高于A组及B组（P＜0.05），D组NOS活性升高至峰值，较A组及B组差异有高度统计学意义（P＜0.01）。造模后6个月，B组NOS活性继续下降，与A组之间差异仍无统计学意义（P＞0.05），C组NOS活性开始反弹性升高，明显高于A组及B组（P＜0.01），D组NOS活性在峰值后开始降低，较A组及B组差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4、图3。

表4 各组大鼠不同时间脊髓NOS活性比较（U/mgprot，）

表4 各组大鼠不同时间脊髓NOS活性比较（U/mgprot，）

注：与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；“-”表示未检测

组别只数1个月3个月6个月A组B组C组D组6 --18 18 18 1.51±0.08 1.67±0.17 2.73±0.11**ΔΔ1.87±0.09*1.65±0.21 2.02±0.11*Δ2.35±0.13**ΔΔ1.55±0.22 2.27±0.13**ΔΔ1.98±0.28*Δ

图3 各组大鼠不同时间脊髓NOS活性动态变化

3 讨论

目前普遍认为颈椎病是多种因素共同作用的结果，包括劳损、创伤、退变、炎症及先天畸形等诸多方面［14-15］。现代生物力学研究显示，人体脊柱的平衡包括动力平衡和静力平衡。现代人们的生活方式改变，长时间低头伏案、异常的姿势、精神紧张等均可产生颈部不良应力，改变颈部肌肉力量，打破平衡，引起肌纤维损伤、肌力减弱，直接导致颈椎动静力平衡破坏及力学性能降低而加剧颈椎的退变［16］。本研究通过人为切断实验大鼠部分颈部伸肌，以破坏颈椎动力稳定系统，从而建立颈部不良应力动物模型，借鉴目前脊髓损伤方面研究成果，以RT-PCR法检测不同时段大鼠脊髓组织iNOS mRNA的表达情况，探索颈部不良应力与脊髓神经组织损害的相关性。

NO作为一种炎症介质，在体内是以左旋精氨酸为底物并在NOS的催化作用下形成的，NOS是NO合成的关键酶。目前研究显示NOS主要有三型：Ⅰ型神经元型，Ⅱ型诱导型；Ⅲ型内皮型。iNOS的生物活性不依赖于钙及钙调蛋白，一般情况下不表达，在免疫刺激、细胞因子、创伤缺血等条件下经转录和翻译才表达，在激活后其活性持续时间较长，持续产生的NO可能在中枢神经系统缺血后迟发性神经元损伤中起重要作用［17-21］。本研究结果显示，由于颈后肌群的损伤引起颈部应力不良，从而诱导iNOS的表达及NOS活性升高，局部NO升高，而全身NO不一定升高，而对局部周围组织产生继发损害。还通过与A组和B组的对比发现，C组和D组的iNOS mRNA表达及NOS活性均有所增加，C组的iNOS mRNA表达量高于后浅肌群损伤组D组，且C组的NOS活性升高早于D组。

综上所述，本研究证明颈部肌肉应力不平衡是慢性颈脊髓损伤的一个重要原因，但受限于实验条件的影响，未能完全模拟人体颈部应力不良的情况，肌肉应力不平衡是否为颈椎病的始动因素有待更多的实验研究进一步观察。

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ExPerimental research of effect of cervical vertebra adverse stress on ex-Pression of inducible nitric oxide synthase in rat sPinal cord

SHEN Lufeng1ZHANG Suihui2DONG Xieping3DU Xiaomei1SUN Yanqun4
1.Department of Rehabi1itation Medicinia1，Jiangxi Provincia1 Peop1e's Hospita1，Jiangxi Province，Nanchang330006，China；2.Jiangxi University of Traditiona1 Chinese Medicine，Jiangxi Province，Nanchang330025，China；3.Department of Orthopaedics，Jiangxi Provincia1 Peop1e's Hospita1，Jiangxi Province，Nanchang330006，China；4.Hea1thcare C1inic for Cadres，Jiangxi Provincia1 Peop1e's Hospita1，Jiangxi Province，Nanchang330006，China

Objective To discuss the effect of cervica1 vertebra adverse stress on expression of inducib1e nitric oxide synthase（iNOS mRNA）in rat spina1 cord.Methods Sixty SD-rats were random1y divided into 4 groups：the contro1 group（group A，6 rats）：dea1 with nothing；the sham operation group（group B，18 rats）：on1y given skin incision，without damage to any musc1e；the back deep musc1e injury group（group C，18 rats）：excised the deep musc1e of back cervica1；the back sha11ow musc1e injury group（group D，18 rats）：excised the sha11ow musc1e of back cervica1.The serum IL-6，NO 1eve1s and iNOS mRNA expression and NOS activity changes in rat spina1 cord were dynamica11y observed at 1，3，6 months after surgery.Results①IL-6 1eve1s：compared with group A，IL-6 1eve1s significant1y increased at 3 and 6 months after surgery in group C，at 6 months in group D（P＜0.05）；compared with group B，IL-6 1eve1s significant1y increased at 6 months in group C and group D（P＜0.05）.②NO 1eve1s：compared with group A and group B，serum NO 1eve1s significant1y increased at 6 months after surgery in group C and group D（P＜0.05）.③iNOS mRNA：there was no iNOS mRNA expression in group A and B，iNOS mRNA expression significant1y increased at 3 and 6 months after surgery in group C and group D（P＜0.05）.④NOS activity：1 month after surgery，compared with group A and B，the NOS activity significant1y increased in group C（P＜0.01），which in group D was higher than group A（P＜0.05）；3 and 6 months after surgery，there were statistica11y significant difference in NOS activity between group C，D and group A，B（P＜0.05）.Conclusion The adverse stress of cervica1 vertebra may 1ead to chronic injuries of cervica1 spina1 cord.

Adverse stress of cervica1 vertebra；Induced nitric oxide synthase；Nitric oxide；Gene expression

R651.2

A

1673-7210（2016）07（c）-0025-04

2016-04-22本文编辑：程铭）

江西省青年科学基金项目（20122BAB215051）。