犬瘟热病毒N基因原核表达及多克隆抗体的制备

李丹丹，刘　柱，丁明洋，李传峰，陈宗艳，张淼涛，刘光清

（1.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.甘肃农业大学动物医学院，兰州 530005）

犬瘟热病毒N基因原核表达及多克隆抗体的制备

李丹丹1,2，刘柱1,2，丁明洋3，李传峰2，陈宗艳2，张淼涛1，刘光清2

（1.西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.甘肃农业大学动物医学院，兰州 530005）

采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因，将其克隆至原核表达载体pET-32a（+）中，构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒，然后转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白，制备多克隆抗体，采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因，重组N蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中得到表达，制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。

犬瘟热病毒；N蛋白；原核表达；多克隆抗体

犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）、麻疹病毒属（Morbillivirus），为单股不分节段的负链RNA病毒[1]。CDV基因组由15 690个核苷酸组成，编码6个结构蛋白：核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、聚合酶蛋白（L）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）及血球凝集素蛋白（H）[2]。CDV N蛋白基因由1572个核苷酸组成，编码523个氨基酸，N 蛋白是病毒核衣壳的主要成分，有包裹及保护内部基因的功能，且是保守性较强的免疫源性蛋白，当病毒感染时可引起强烈抗体反应[3]。

犬瘟热病毒能引起犬、狐、貂等动物的犬瘟热疾病，近年也有犬瘟病毒热感染大熊猫的病例。犬瘟热是一种急性、高度接触性传染病，严重危害当前养犬业和皮毛动物养殖业的发展。虽然疫苗的应用缓解了犬瘟热的发展，但是近年来不断有报道显示，已接种疫苗的犬仍可感染CDV，犬瘟热的宿主范围也在不断扩大，推测其与新型CDV毒株出现有关[4]。本研究构建 CDV N基因的重组表达质粒 pETCDV-N，在大肠杆菌中表达后，对重组表达蛋白进行纯化，并制备多克隆抗体，以期为 CDV 免疫学检测及进一步研究 CDV N 蛋白的功能奠定基础。

1　材料与方法

1.1菌株与质粒Trans5α和BL21（DE3）感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司；pET-32a（+）载体购自Novagen公司。

1.2主要试剂PFU高保真酶购自Tiangen公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司；EcoR I和Hind III限制性内切酶购自TaKaRa公司（大连）；二氨基联苯胺显色液购自武汉博士德公司；抗His标签鼠单克隆抗体及FITC标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京康为世纪公司；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自中杉金桥公司（北京）；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自BioTake公司。

1.3CDV N基因的扩增根据GenBank中犬瘟热的全基因组序列（登录号：KM434239）设计扩增N基因的引物，上游引物（F）：5′-CCGGAATTCCGGAT GGCTAGCCTTCTCAAGAGCCT - 3′（下划线核苷酸为EcoR I识别位点）；下游引物（R）：5′-TTAA TTGAGTAGCTCCCTATCATTATAGACAGGCCCA AGCTTGGG-3’（下划线核苷酸为Hind III识别位点），预期扩增产物长度为1572 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。提取RNA反转录为cDNA，以获得的cDNA为模板，用2×pfu DNA聚合酶扩增N基因。PCR反应体系：模板cDNA 2μL，pfu Mix 25 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，加灭菌蒸馏水至50 μL。PCR反应条件：95°C预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环；72℃终延伸10 min。同时设立阴性对照，不加模板。取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并用BioTake公司凝胶回收试剂盒回收。

1.4重组表达质粒的构建与鉴定将纯化的N基因和pET-32a（+）载体分别用EcoR I和Hind III双酶切，然后用T4 DNA连接酶连接，再转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞。用氨苄抗性的平板筛选阳性克隆，提取重组质粒，用EcoR I和Hind III 双酶切进行鉴定，送上海美吉生物公司测序，将鉴定正确的重组质粒命名为pET-32a-N。

1.5CDV N基因的诱导表达将pET-32a-N转化到E.coil BL21（DE3）感受态细胞中，经氨苄抗性筛选后，挑取单克隆于氨苄抗性的LB培养基中，于37℃培养至OD600为0.8时，加入IPTG（终浓度为0.6 mmol/L）诱导，分别于不同时间点收集菌液1 mL，4℃、离心5 min，收集菌体沉淀，取合适菌量与5倍浓度上样缓冲液混匀，100℃煮沸10 min，进行SDSPAGE电泳分析[5]。

1.6CDV N融合蛋白的纯化与定量小量收集鉴定菌液培养，称量菌体湿重，每克菌体加入3 mL细胞裂解缓冲液Ⅰ，轻轻用玻璃棒使菌体悬起，每克湿重加入4 μL 100 mmol/L PMSF和80 μL 10 mg/mL溶菌酶，37℃搅动20 min，超声破碎直至不粘稠，超声波工作电压400 V，工作5 s，间隔5 s，4℃、12 000 ×g离心10 min，分别取上清和菌体沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，以确定CDV N蛋白的表达形式。扩大培养表达CDV N蛋白的重组菌，诱导表达CDV N蛋白。参照分子克隆实验指南，从包涵体中纯化蛋白，对纯化产物进行SDS-PAGE电泳鉴定[6]。

1.7兔抗CDV N蛋白多克隆抗体的制备健康新西兰大白兔饲养1周后进行首次免疫，1 mg纯化的重组蛋白与等体积弗氏完全佐剂完全乳化后皮下多点注射。2周后进行第2次免疫，免疫剂量为1 mg纯化后的重组蛋白，与等体积弗氏不完全佐剂完全乳化后皮下多点注射。此后每隔1周免疫1次，剂量与方法同第2次免疫。4免后d5耳缘静脉采血，检测抗体特异性[7]。加强免疫剂量为1 mg纯化后的重组蛋白，耳缘静脉注射。加强免疫后d7，心脏采血，离心制备血清，分装后于-20℃保存。

1.8Western blot检测多克隆抗体特异性加强免疫后1周，兔心脏采血，分离血清，于-80℃分装保存。以CDV N融合蛋白为抗原，Western blot检测多克隆抗体的特异性，待检血清按照1:1000倍稀释作为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗（1:2000稀释），二氨基联苯胺法显色[9]。

1.9间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay，IFA）将接种CDV 48 h后的BHKSLAM细胞用4%多聚甲醛固定，4℃过夜封闭，用制备的N蛋白多克隆抗体为一抗（1:200稀释），室温孵育2 h后，加入FITC标记的羊抗兔二抗（1:10 000稀释），室温孵育1 h，荧光显微镜下观察。同时设置正常BHK-SLAM细胞为阴性对照。

2　结果

2.1目的基因的扩增重组表达质粒的鉴定以获得的犬瘟热cDNA为模板，成功扩增出N基因，其长度为1572 bp（图1A）。采用酶切、连接方法，将其插入到pET-32a（+）载体中，得到了pET-32a-N。进一步酶切鉴定出现2条特异性条带，分别为1572 bp左右和5900 bp左右（图1B），表明目的基因已插入相应的克隆位点，测序结果进一步证实载体构建成功。

2.2CDV N蛋白表达pET-32a-N转化E.coil BL21（DE3）感受态细胞后，加入IPTG诱导，并取不同时间点的重组菌液对比表达情况。结果表明诱导4～6 h可使N融合蛋白得到最大表达，CDV N蛋白为57 kDa，His标签蛋白为18 kDa，获得的重组蛋白大小在76 kDa（图2A），与预期结果一致。CDV N蛋白优化结果发现，IPTG诱导6 h后，蛋白表达量达到最大[9]。

2.4表达产物的纯化与定量按照上述方法对重组蛋白进行纯化，纯化后得到1条76 kDa的条带，与预期结果相符（图2B）。用碧云天公司蛋白定量试剂盒定量分析得到pET-32a-N融合蛋白浓度为1.2 mg/mL。

图1　CDV N基因扩增结果(A)及重组质粒pET-32a-N双酶切鉴定(B)Fig. 1　Amplifi cation of CDV N gene(A) and analysis of pET-32a-N by restriction enzyme digestion(B)

图2　重组N蛋白的SDS-PAGE分析及纯化Fig. 2　SDS-PAGE analysis and purifi cation of recombinant N protein

2.5重组蛋白pET-32a-N多抗的鉴定将纯化后的N蛋白分4次免疫实验兔，得到抗N蛋白的高免血清，即多克隆抗体。为了检测抗体的特异性，将纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳，之后将蛋白转印到PVDF膜上，转印条件均为：15 V、30 min。使用的一抗为本试验制备的抗N基因多克隆抗体（1:1000稀释），二抗为HRP标记的羊抗兔IgG（1:2000稀释）。Western blot检测结果如图3所示，在约76 kDa处出现特异性反应带，说明制备的多抗具有反应原性。

图3　重组 N 蛋白Western blot鉴定结果Fig. 3　Identifi cation of the recombinant N protein by Western blot

2.6间接免疫荧光试验（IFA） BHK-SLAM细胞接种CDV 48 h后，用IFA检测抗原的表达情况。使用的一抗（1:200稀释）为本试验制备的抗N基因多克隆抗体，二抗为FITC标记的羊抗兔IgG（1:10 000稀释）。结果显示，在荧光显微镜下可观察出现特异性荧光（图4A），阴性对照组无荧光（图4B），说明所制备的多克隆抗体具有较好的特异性。

图4　CDV感染BHK-SLAM细胞的间接免疫荧光检测Fig. 4　IFA results of BHK-SLAM cells infected with CDV

3　讨论

N蛋白是 CDV中含量最高的结构蛋白，对病毒的转录、复制、装配及持续感染都具有重要意义[10]。在CDV N蛋白281～289位连续9个氨基酸高度保守，是T细胞表位，在细胞免疫中发挥重要的功能[11]。CDV N蛋白可以刺激机体产生强烈的抗体反应，尤其在感染早期免疫应答中起主导作用，发挥体液免疫功能。当H和F蛋白的特异性抗体不能检出时，仍可检测到N蛋白的特异性抗体[11]。所以CDV N蛋白基因无论是做为诊断抗原还是基因工程疫苗都具有很高的价值。

鉴于 CDV N 蛋白良好的抗原性，本研究选取CDV N 蛋白构建重组质粒 pET-32-N，在大肠杆菌中表达重组蛋白 N，该蛋白以包涵体形式表达，降低了胞内外源蛋白浓度，提高了重组蛋白在大肠杆菌中的表达量[12]。通过纯化得到高纯度重组蛋白，Western blot 鉴定结果表明，表达的 CDV N重组蛋白具有良好反应原性，可作为间接 ELISA诊断抗原，为建立ELISA 抗体诊断试剂盒奠定了基础[13]。

虽然多克隆抗体特异性和稳定性不如单克隆抗体，但其可识别同一抗原的多个表位，与抗原具有较高的亲和性，故在免疫检测中可提高检测的灵敏度[14]。同时多克隆抗体具有制备简单、成本低、耗时短等优点，在免疫学研究中得到了广泛应用。本研究表达的重组蛋白抗兔 N 蛋白抗体可特异性识别感染细胞中的 CDV N蛋白，说明其具有良好的反应原性，可用于病毒抗原检测，制备的多克隆抗体同时也为进一步进行 N 蛋白功能分析研究奠定了基础。

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PROKARYOTIC EXPRESSION OF N GENE OF CANINE DISTEMPER VIRUS AND PREPARATION OF POLYCLONAL ANTIBODIES

LI Dan-dan1,2, LIU Zhu1,2, DING Ming-yang3, LI Chuan-feng2, CHEN Zong-yan2, ZHANG Miao-tao1, LIU Guang-qing2

(1. Department of Animal Medicine of Northwest A&F University, Yanling 712100, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China ; 3. Gansu Agriculture University, Lanzhou 730070, China)

To study the function of N protein of Canine distemper virns (CDV), the CDV-N gene was amplifi ed in PCR and cloned into expression vector pET-32a(+). Subsequently, the recombinant plasmid pET-32a-N was transformed into E.coli BL21(DE3) cells prior to induction with IPTG. The CDV-N protein was purifi ed from the inclusion bodies. The PCR product of the CDV N gene was 1572 bp in length. The recombinant N protein was used to immunize rabbits to produce polyclonal antibodies. The rabbit antiserum was sampled and its specifi city for N protein was confi rmed in Western blot.

Canine distemper virns (CDV); N protein; prokaryotic expression; polyclonal antibody

S852.659.5

A

1674-6422（2016）03-0001-05

2016-02-02

国家自然科学基金项目（31270194、31502068）；上海市科技兴农重点攻关项目（2016043）；上海市科委创新项目(13391901602)；公益性农业科研专项（201303046）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2016JB01、31101848)

李丹丹，女，硕士研究生，基础兽医学专业

刘光清，E-mail：liugq@shvri.ac.cn；张淼涛，E-mail：504888520@qq.com