氨基酸原料中游离氨基酸测定及风险评估

吕乐福　赵旭东　张红卫　刘强林　高翔　杜建光

摘要：利用氨基酸自动分析仪对氨基酸原料进行氨基酸种类和含量测定分析，采用原子吸收分光光度计和可见光分光光度计测定了Pb、Cd、Cr和As有害元素含量并进行分析比较。结果表明：氨基酸原料A1、A2和A3样品中均含有17种氨基酸，其总含量分别为51.63%、46.29%和61.90%。该测定方法精密度和准确度高，平均回收率为96.23%～100.77%，相对偏差RSD为0.67%～2.15%。三种氨基酸原料中有害元素Pb、Cd、Cr和As含量分别为6.46～91.41、4.35～13.21、7.53～13.12mg/kg和1.34～2.08mg/kg，在含氨基酸肥料生产中，氨基酸原料经过稀释后可以达到国家相关标准限量值要求，但仍需加强监管。

关键词：肥料；氨基酸；重金属；风险评估

中图分类号：S146⁺.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0129-05

氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的统称，在农业上有着重要作用。一方面氨基酸分子可以被植物直接吸收利用，提高植物的产量和品质；另一方面对土壤酶活性和有机氮矿化也有直接影响。正是由于上述特性，使得含氨基酸叶面肥料、水溶性肥料和有机肥料迅速发展壮大，且在农业领域广泛应用。氨基酸原料大多是利用废弃动植物蛋白质资源经酸解、碱解、酶解或微生物发酵提取的，由于有机废弃物中成分复杂、杂质多，且生产过程和浓缩步骤繁琐，稍有不慎就可能造成产品质量差，甚至残留部分有害物质。因此，有必要对氨基酸原料进行检测和评估，确保肥料生产的安全。

氨基酸原料中主要成分为游离氨基酸，对于氨基酸的分析多采用柱后衍生离子交换色谱法、柱前衍生反相高效液相色谱法、阴离子交换色谱一脉冲积分安培法、超高压色谱法、毛细管电泳法和凯氏定氮法等。然而这些方法中有些操作复杂且仪器不普及，或试剂昂贵、或分离效率低，甚至有些方法不能够同时测定多种氨基酸。考虑到上述因素，结合实际情况，本研究选择操作简单、重现性好、灵敏度高的氨基酸自动分析仪法对氨基酸原料中的游离氨基酸进行分析和评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料购自临沂市辖区内肥料生产企业，三个样品均为固态粉末状，颜色棕黄色，分别记为：A1、A2和A3。主要试剂包括：混合氨基酸标准液（2.5μmol/mL），购自美国Sigma公司；缓冲液（B1、B2、B3和B4）和再生液（RG），购自三菱化学株式会社；显色液（R1和R2），由日本和光纯药工业株式会社生产；盐酸、硝酸、硫酸均为优级纯，市售；氢氧化钠、柠檬酸钠、EDTA、磺基水杨酸等均为分析纯，市售。实验用水全部为去离子水。无磷滤纸，三水牌（φ11cm），潍坊检验技术研究所生产。

1.2 仪器与设备

电子天平（0.0001g），AL204型，梅特勒-托利多仪器公司；全自动氨基酸分析仪（色谱柱-日立专用离子交换树脂#2622SC，4.6mm×60mm），Hitachi L8900型，日本日立高新技术株式会社；原子吸收分光光度计（配有空气-乙炔燃烧器），安捷伦AA240型，美国安捷伦科技有限公司；高速台式离心机，TGL-15B型，上海安亭科学仪器厂；数显恒温水浴锅，HH-4型，上海蓝凯仪器仪表有限公司；电热板，SY-2型，金坛市晶玻实验仪器厂；可见分光光度计，722G型，上海精密科学仪器有限公司；往复式振荡机，HY-4KS型，金坛市新航仪器厂；酸度计，PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司；数字电导率仪，DDS-11A型，上海雷磁创益仪器仪表有限公司；电热恒温干燥箱，202型，山东潍坊医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 氨基酸测定方法 参照GB/T17419-1998《含氨基酸叶面肥料》中规定的方法测定样品中的游离氨基酸。具体步骤为：准确称取2.000g样品，置于250mL容量瓶中，定容一摇匀后放置过夜，第二日用移液管吸取2mL上清液置于10mL硬质离心管中，随后加入2mL浓度5%的磺基水杨酸溶液，摇匀，静置1h，再加入1mL浓度1%的EDTA溶液和1mL0.06mol/L HCl溶液，混匀后，用高速离心机以4500r/min离心15min，用移液管吸取1mL上清液于10mL玻璃试验管中，水浴蒸干。最后用2mL pH2.2的柠檬酸钠缓冲溶液溶解结晶沉淀，用注射器将溶解液打人测试瓶中，待测。将上述250mL容量瓶中剩余上清液分别倒入3个50mL烧杯中，用pH计和电导率仪分别测定溶解液的pH值和EC值。同时做空白处理（去离子水），记为DW，下同。

加标回收方案具体为：分别移取上述250mL容量瓶中上清液1.0mL和0.1n mol/μL混合氨基酸标准液1mL于10mL硬质离心管中，后续处理同上。

氨基酸自动分析仪参数设置：柱温设为57℃；反应温度设为135℃；自动进样器冲洗不少于3次；用外标法定量，进样量20μL。

1.3.2 重金属测定方法 重金属（Cd、Cr、Pb和As）测定参考GB/T23349-2009《肥料中砷、镉、铅、铬、汞生态指标》中规定方法。具体为：准确称取5.000g样品于400mL高型烧杯中，在通风橱里分别向烧杯内加入30mL盐酸和10mL硝酸，盖上表面皿，静置10min，在可调式电热板上慢慢加热，待激烈反应结束后，移开表面皿，继续加热至近干。稍微冷却后，加入50mL盐酸溶液（1+5）并加热溶解，冷却至室温后定容到250mL容量瓶中，摇匀，用定量滤纸干过滤，滤液待测备用。其中，Cd、Cr和Pb用空气-乙炔燃烧-原子吸收分光光度法进行测定；As采用二乙基二硫代氨基甲酸银分光光度法测定。

1.4 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2007软件、SPSS 18.0软件和OrigiPro 8.0进行计算分析。

2 结果与分析

2.1 混合氨基酸标准样品测定分析

采用保留时间法对样品中氨基酸定性，即在相同色谱分析条件下，样品中的氨基酸色谱峰与氨基酸标准色谱峰保留时间相同或者相近，那么就认为样品中含有此种氨基酸。图1为去离子水空白处理和17种氨基酸混合标准样品衍生化后的色谱分析图。从图1a可以看出，空白处理仅有一个小小的NH₃峰，因此不含有任何氨基酸，说明在试验操作过程中不存在引入外源氨基酸而影响检测结果的可能性。图1b可知，17种氨基酸混合标准样品按照分离时间依次为：Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg。各氨基酸峰的基部没有黏连或重合部分较少，说明仪器工作正常，分离度较高，可以满足检验检测的要求。

2.2 不同样品氨基酸测定分析

氨基酸常为兼性离子态存在，其本身既是酸又是碱。按照氨基酸性质可大致分为酸性氨基酸（Asp和Glu）、碱性氨基酸（Lys、His和Arg）、中性氨基酸（Thr、Ser、Pro、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Tyr和Phe）和含硫氨基酸（Cys和Met）四类。由表1可知，不同样品中氨基酸的含量不同。其中，去离子水空白处理（DW）不含任何氨基酸，检测结果值均为0，这与图1a显示的结果一致。样品A1中Glu含量最高，为8.48%；Met含量最低，为0.50%。样品A2中Ala含量最高，为10.68%；Ser含量最低，为0.47%。样品A3中Glu含量最高为10.22%；Met含量最低，为0.47%。根据氨基酸l生质来区分，A1、A2和A3三个样品中酸性氨基酸、碱性氨基酸、中性氨基酸、含硫氨基酸含量分别为：12.26%、6.58%、30.96和1.83%；3.09%、2.80%、37.08%和3.32%；14.67%、7.91%、37.44%和1.88%。三个样品中氨基酸含量构成从大到小均呈现为：中性氨基酸>酸性氨基酸>碱性氨基酸>含硫氨基酸。从总量上看，样品A3含量最高（61.90%），其次为样品A1（51.63%），样品A2含量最低（46.29%）。

从表1还可以看出，各氨基酸平均回收率在96.23%～100.77%之间，变异系数RSD除Leu外均小于2%，说明测定方法和仪器状态均可满足分析研究的需要，对氨基酸原料中游离氨基酸的提取具有较好的适用性和可靠性。

2.3 浸提液pH值与EC值

从图2可知，与去离子水空白处理（DW）相比，各氨基酸样品浸提液均呈酸性，pH值较DW处理降低了5.80%～24.64%。三个氨基酸样品中，浸提液pH值从小到大依次为：A1+