潍县萝卜茎叶功效成分分子追踪及生物活性研究

李桂凤　张丽　王燕燕　王洪亮　李星星　邱法武

摘要：为探明潍县萝卜茎叶的功效成分，追踪其分子结构，本研究采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析及RP-18色谱柱等对潍县萝卜茎叶甲醇提取物进行分离和纯化，共获得了18个化合物，分别是芥子油（Mustard oil）、芥子酸甘油酯（脂肪油，Mustard acid glyceride）、芥子碱硫氰酸盐（脂肪油，Sinapine thiocya-nate）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、γ-谷甾醇（γ-sitosterol）、萝卜苷（Glucoraphanin）、胡萝卜苷（Daucosterol）、胆碱（choline）、亚麻酸（Linolenic acid）、莱菔素（sulforaphene）、黄酮（F1avone）、十八碳二烯酸（Octadecadienoicaeid）、十六碳一烯酸（Hexadeeylenic aeid）、十八碳一烯酸（Vaccenic aeid）、十四烷酸（Myristic acid）、亚麻脑苷脂（Linum cerebroside）、十八烷酸（Octadecanoic acid）、二十烷酸（Eicosanoic aeid）。其中，纯度达95%的亚麻脑苷脂为首次从植物中获得，并通过理化性质分析和Ms、NMR等波谱方法对其结构进行了鉴定。另外，莱菔素具有重要的生物活性，1mg/mL莱菔素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有显著的抑制作用。

关键词：潍县萝卜茎叶；功效成分；分子追踪；生物活性

中图分类号：S631.101 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0050-04

潍县萝卜是一种食药皆优的常食蔬菜，其茎叶营养丰富，含有大量的活性物质。研究表明，萝卜茎叶中含有的莱菔素，具有很好的防癌抗癌功效及杀菌消炎解毒等作用；含有的糖化酵素，能分解食物中的亚硝胺，可大大降低其致癌作用；含有较多的木质素，能使体内巨细胞吞噬癌细胞的活力提高2～4倍；含有的芥子油和粗纤维，可促进胃肠蠕动，推动大便排出；含有的莱酿脑、淀粉酶等成分，具宽胸利气、健胃消食的功能等。

但由于目前家庭保鲜技术相对滞后，以及人们习惯只吃萝卜而丢掉其茎叶，造成大量资源的浪费，仅潍坊地区每年就有近15×10²kg的萝卜茎叶成为垃圾，造成环境污染。本研究通过对潍县萝卜茎叶的功效成分进行分子追踪研究，以期为其综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：潍县萝卜茎叶于2014年11月18日采于潍坊市寒亭区黄埠村，洗净后50℃烘干，粉碎过20目筛备用。由山东师范大学生命科学学院李法曾教授鉴定。标本保存于山东绿原农业科技研究院课题组（编号：zxs-188）。

试剂：石油醚、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ZF-6型三用紫外线分析仪（254nm UV灯泡，全套旋转蒸发仪装置）；超导核磁共振仪Bruker AM-400型；柱层析硅胶（200～300目），薄层层析硅胶GF254（10～40μm）；SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱，辅以5%H₂SO₄-乙醇溶液，加热显色。

1.3 分离纯化

将干燥粉碎的潍县萝卜茎叶（10008g）在室温下用甲醇浸泡提取4次，每次浸泡4天，合并粗提液（约18L），真空减压浓缩得到粘稠暗绿色浸膏（约108g）。浸膏用蒸馏水稀释后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，分别合并各萃取液（各相均约1800mL），真空减压浓缩得到石油醚部位61.85g，乙酸乙酯部位28.91g。

经硅胶柱分离，石油醚部位，拌样上300目硅胶柱，进行层析，以石油醚-氯仿-甲醇梯度洗脱：石油醚-氯仿（2：1，V：V，下同）洗脱获得1～5号化合物，石油醚-氯仿（1：1）洗脱获得6、7号化合物，氯仿-甲醇（100：1）洗脱获得8、9、10号化合物，氯仿-甲醇（50：1）洗脱获得11、12号化合物，氯仿-甲醇（25：1）洗脱获得13、14号化合物，氯仿-甲醇（10：1）洗脱获得15号化合物。其中石油醚-氯仿（1：1）洗脱下的产物，干燥后呈现黑兼白色球状固体，将其用丙酮或石油醚或其混合物洗出白色絮状物质，用甲醇重结晶得到乳白色粉末结晶，命名为X16化合物，经波谱解析被鉴定为新化合物。乙酸乙酯部位，拌样上300目硅胶柱，经多次硅胶柱层析及氯仿-甲醇（200：1）洗脱，得到17号和18号化合物。

2 结果与分析

2.1 功效成分的分离鉴定

通过结晶与重结晶及色谱纯化等方法共分离出18种化合物，经理化鉴定、薄层色谱及四大光谱方法鉴定，确定了17种化合物，分别为芥子油（Mustard oil）、芥子酸甘油酯（脂肪油，Mustardacid glyeeride）、芥子碱硫氰酸盐（脂肪油，Sinap-ine thiocyanate）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、γ-谷甾醇（γ-sitosterol）、萝卜苷（Glueoraphanin）、胡萝卜苷（Daucosterol）、胆碱（Choline）、亚麻酸（Linolenic acid）、莱菔素（Sulforaphene）、黄酮（Flavone）、十八碳二烯酸（Oetadeeadienoie acid）、十六碳一烯酸（Hexadecylenic acid）、十八碳一烯酸（Vaccenic acid）、十四烷酸（Myristie acid）、亚麻脑苷脂（Linum cerebroside）、十八烷酸（Octade-canoic acid）、二十烷酸（Eicosanoic acid）。X16化合物为首次从植物中获得的化合物，本试验对其结构进行了进一步的分析、鉴定。

2.2 X16化合物理化性质及结构鉴定

经提取、分离、纯化至纯度达95%时，采用Bruker AM-400型超导核磁共振仪测定X16化合物的C、H图谱，见表1。

经波谱解析，X16化合物为白色结晶状粉末，10%硫酸乙醇溶液显色呈现紫黑色斑点。溶于甲醇，微溶于氯仿，不溶于石油醚或丙酮。高分辨电喷雾质谱表明其分子式为C₄₈H₉₁NO₁₀，精确分子量842.6738（计算值842.6716，C₄₈H₉₂NO₁₀）。在化合物的核磁共振碳谱中化学位移为103.4（C-1″）、73.3（C-2″）、76.4（C-3″）、69.9（C-4″）、76.8（C-5″）和60.9（C-6″）的6个碳信号表明分子中存在葡萄糖基。氢谱中化学位移4.14的端基氢（1H，d，J=7.8 Hz，H-1″），表明该葡萄糖为B构型。氢谱中化学位移1.24处显示多个亚甲基质子信号，碳谱中28.4～29.1处也有多个亚甲基碳信号，表明结构中含有长脂肪链；但氢谱和碳谱均只有两个甲基信号，表明脂肪链没有支链。碳谱中化学位移49.7的碳与胺基（-CH-NH-）相连，表明两条长脂肪链通过胺基相连。

通过以上分析，推测X16为脑苷脂类化合物，其结构为一条长脂肪链与一条长脂肪胺链相连（见图1）。核磁共振谱亦显示存在两个双键（谱图中8和9之间对应C为129.2和130.2，H对应为5.37（2H，m）；15，16之间对应C为129.3和129.5，H对应为5.32（2H，m），由此可确定两个双键的具体位置，经与文献对比，该化合物最终被确定为1-氧-（β-D-葡萄糖）-（2S，3S，4R，8E）-2-[（2R）-2-羟基-24酸-15-烯酰胺]-8-18烯-1，3，4-三醇，即亚麻脑苷脂。

2.3 莱菔素的抑菌试验

莱菔素是一种天然植物抗生素，主要存在于萝卜种子中，对金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、分枝杆菌、百日咳杆菌及大肠杆菌等细菌以及某些致病性真菌具有明显的抑制作用。本研究结果显示，潍县萝卜茎叶中也含有一定数量的莱菔素，提取后对其抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的效果进行了试验研究，具体如下。

2.3.1 莱菔素的抑菌试验方法 莱菔素的抑菌效果采用纸碟法进行测定。将保存的菌株移到LB固体培养基（胰蛋白胨粉10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉3.5g/L，pH7.0）上进行活化培养，再在LB固体培养基上进行批量培养，用无菌水配制成10⁵～10⁶个/mL的菌悬液，在无菌环境下向每套培养皿（D=9cm）中加入菌悬液1.5mL，迅速倒入约12mLLB培养基。摇匀后冷却成平板，将蘸有不同浓度酒精（1：2、1：4、1：8、1：16，V：V）稀释的莱菔素无菌吸水纸片（D=5mm）放置于平板上，并用浸酒精的吸水纸做阴性对照，以链霉素做阳性对照，置28℃恒温培养箱内培养，每个浓度处理重复3次。分别于24、48h测量抑菌圈大小，评价抑菌效果。

2.3.2 莱菔素的抑菌效果 不同浓度莱菔素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果见表2。浓度越大，抑菌圈越大，抑菌效果越好。1.0mg/mL莱菔素基本可以完全抑制菌体生长。

3 结论与讨论

潍县萝卜的茎叶经50℃烘干，粉碎，浸提，30℃蒸干，萃取，分离，纯化，获得芥子油（Mustardoil）、芥子酸甘油酯（脂肪油，Mustard acid glyeer-ide）、芥子碱硫氰酸盐（脂肪油，Sinapine thiocya-nate）、β-谷甾醇（β-sitoster01）、γ-谷甾醇（γ-sitosterol）、萝卜苷（Glucoraphanin）、胡萝卜苷（Daucosterol）、胆碱（Choline）、亚麻酸（Linolenicacid）、莱菔素（Sulforaphene）、黄酮（Flavone）、十八碳二烯酸（Octadecadienoic acid）、十六碳一烯酸（Hexadecylenic acid）、十八碳一烯酸（Vaccenicacid）、十四烷酸（Myristic acid）、亚麻脑苷脂（Li-Hum cerebroside）、十八烷酸（Octadecanoic acid）、二十烷酸（Eicosanoic acid）18个化合物。其中亚麻脑苷脂具有重要的生物活性，本试验为亚麻脑苷脂首次从植物中获得。此外，莱菔素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果试验显示0.6～1.0mg/mL莱菔素的抑菌效果明显。