对-香豆酸与人血清白蛋白相互作用的荧光和表面增强拉曼光谱研究

申炳俊, 金丽虹, 张佳佳, 刘荣娟, 刘占伟, 刘昱鑫, 柴 浩, 田 坚*

(1. 长春理工大学 清洁能源技术研究所， 吉林 长春 130022; 2. 长春理工大学 生命科学技术学院， 吉林 长春 130022)



对-香豆酸与人血清白蛋白相互作用的荧光和表面增强拉曼光谱研究

申炳俊1, 金丽虹2, 张佳佳2, 刘荣娟2, 刘占伟2, 刘昱鑫2, 柴 浩2, 田 坚1*

(1. 长春理工大学 清洁能源技术研究所， 吉林 长春 130022; 2. 长春理工大学 生命科学技术学院， 吉林 长春 130022)

在模拟生理条件下，应用荧光光谱和表面增强拉曼光谱法对对-香豆酸(p-CA)与人血清白蛋白 (HSA) 的结合机理进行研究。结果表明，p-CA对HSA的荧光猝灭机制为静态猝灭，并伴有非辐射能量转移。荧光光谱显示，在298，304，310 K下，p-CA与HSA的结合常数(KA)分别为3.41×104，2.09×104，1.38×104L/mol，结合位点数(n)近似为1。表面增强拉曼光谱研究揭示，p-CA的酚基与HSA有效结合。标记竞争实验指出，p-CA在HSA上的结合位点主要在SiteⅠ。反应过程热力学参数表明，二者间的作用主要为静电引力，且根据Förster能量转移理论求得p-CA与HSA间的距离为 5.11 nm。同步荧光光谱显示，p-CA的结合没有导致HSA构象发生明显变化。

荧光光谱； 表面增强拉曼光谱； 对-香豆酸； 人血清白蛋白； 反应机理

Investigation on The Interaction betweenp-Coumaric Acid and Human

1 引 言

人血清白蛋白(Haman serum albumin，HSA)是人血浆中含量最丰富的载体蛋白，担负着药物的贮存、运输等功能，常常作为研究药物与蛋白质相互作用的模型蛋白[1]。药物吸收后进入血液循环，可与血清蛋白质以非共价方式结合，其聚集状态及在机体中的分布、代谢等生理过程都受到血清白蛋白的影响。同时，药物与蛋白质的结合也会影响蛋白的构象和功能。因此，研究药物分子与HSA的结合作用，有助于深入了解药物在体内的运输、代谢机制、药代动力学及蛋白质构象，具有重要的意义。

对-香豆酸(p-Coumaric acid，p-CA)化学名称为对-羟基肉桂酸，属于酚酸类化合物，是白花蛇舌草、海金莎草、杜仲叶等中草药的主要活性成分之一。p-CA具有抗肿瘤、抗氧化、预防心血管疾病、抗菌消炎和利胆等明显的生物活性，亦对肝的诱变和氧化损伤具有保护作用[2-6]，广泛应用于医药、食品、日用品和饲料等领域。近年来，对p-CA的提取、分离、分析、药效和药理的研究已有不少报道，但在分子水平研究p-CA与HSA的相互作用尚未见报道。

荧光光谱法是研究药物与HSA相互作用的最有效方法之一[7-9]，该方法可对药物分子在HSA上的结合常数、结合位点数和结合力类型等非共价作用特性及药物引起的HSA构象、结构变化等方面信息进行研究。表面增强拉曼光谱法(Surface enhanced Raman scattering，SERS)对研究分子内和分子间的相互作用非常敏感，可提供有关分子构型和化学键变化方面的信息[10-12]。

本文利用荧光光谱和表面增强拉曼光谱技术研究了p-CA与HSA的相互作用信息及p-CA对HSA构象的影响，为更好地了解p-CA药理作用提供理论支持。

2 实 验

2.1 仪器及试剂

实验中使用的仪器主要有QE65000拉曼光谱仪(美国海洋公司)、F-280荧光分光光度计(天津港东公司)、320 pH计(上海梅特勒-托利多仪器公司)、DC-4006高精度恒温水浴(上海菁海仪器公司)和QL-901振荡器(江苏其林贝尔仪器公司)等。

人血清白蛋白(美国Sigma公司)配成浓度为1.0×10-4mol/L 的储备液。对-香豆酸对照品(成都普菲德公司)配成浓度为2.0×10-3mol/L 的储备液，用时适当稀释。华法林(南通飞宇公司)、布洛芬(德国Dr. Ehrenstorfer公司)和洋地黄毒苷(德国Dr. Ehrenstorfer公司)3种对照品均配成浓度为1.0×10-4mol/L的储备液。上述储备液置于4 ℃冰箱中保存。缓冲溶液是浓度为0.05 mol/L的Tris-HCl(内含0.1 mol/L的NaCl，pH=7.4)，实验用水为二次去离子水，其他试剂均为分析纯。荧光值用“内滤光效应”公式[13]进行校正：

(1)

Fcor和Fobs为p-CA-HSA校正后和测量的荧光强度，Aex和Aem为p-CA在激发和发射波长处的吸光度值。

2.2 实验方法

2.2.1 荧光光谱

荧光发射谱的测定：在5 mL比色管中依次加入40 μL HSA储备液和一定量的1.0×10-4mol/Lp-CA溶液，用pH 7.4 Tris-HCl缓冲液定容，充分混合，于恒温水浴中作用30 min。固定激发波长为280 nm，入射和出射狭缝均为5 nm，记录荧光发射谱。

同步荧光测定：溶液配制同上，设置发射和激发狭缝宽度为5 nm，固定波长差Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，扫描同步荧光光谱。

标记竞争实验：固定HSA和位点标记试剂的浓度为1.0×10-6mol/L，充分混合，于恒温水浴中作用30 min，向标记试剂-HSA体系中分别加入一定体积的p-CA溶液，混合均匀，继续在该温度水浴中反应30 min，扫描荧光光谱，参数同前。

2.2.2 拉曼光谱

理论计算：利用密度泛函理论(DFT)，在B3LYP/6-311+ +(d,p)基组水平上优化p-CA几何结构，获得该分子的全部振动频率。频率修正因子为0.961 3[14]，所有计算均采用Guassian 09程序完成。

NRS测定：将p-CA固体标样置于载玻片上，进行NRS测试。激发光波长为785 nm，达到样品表面功率为100 mW，光谱分析范围为0～2 000 cm-1，分辨率为2 cm-1，积分时间为10 s，累积3 次。

SERS测定：参照经典的Lee法[15]制备银溶胶。将0.5 mLp-CA溶液加入到一定体积的HSA储备液中，配制终浓度比分别为1∶0，1∶1，1∶3，1∶5的混合液，pH=7.4 条件下作用30 min进行药物与HSA识别；与0.5 mL银溶胶溶液混合，作用30 min后进行SERS测定。测试条件同NRS。

3 结果与讨论

3.1p-CA对HSA的荧光猝灭作用及机理

图1为p-CA对HSA的荧光猝灭光谱，激发波长为280 nm。可以看出，HSA在340 nm处出现最大荧光发射峰。随着药物浓度的不断增加，HSA的内源性荧光强度发生有规律的猝灭，但峰位和峰形基本保持不变。这表明p-CA能够猝灭CHSA=1.0×10-6mol/L； 1～7:Cp-CA=(0, 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0)×10-6mol/L； 8: Cp-CA=1.0×10-6mol/L。

图1p-CA对HSA的荧光猝灭光谱(T=298 K)

Fig.1 Fluorescence quenching spectra ofp-CA on HSA (T=298 K)

HSA的荧光，二者间存在相互作用。在280 nm激发下，p-CA分子在340 nm处无荧光产生，但是在430 nm处产生强度很弱的荧光发射峰(见图1中曲线8)，其荧光强度随p-CA浓度增加逐渐下降，这进一步揭示，p-CA与HSA间可能生成复合物。

猝灭数据按动态Stern-Volmer方程处理[16]：

(2)

式中，F0、F分别为无、有p-CA时的荧光强度；τ0为分子荧光平均寿命，约为10-8s；Kq为猝灭速率常数；KSV为Stern-Volmer猝灭常数；[Q]为p-CA平衡浓度。结果列于表1。由表1可知，KSV随温度升高而减小，Kq值均大于最大扩散碰撞猝灭常数(2×1012L/(mol·s))[17]，表明p-CA与HSA形成稳定的非共价复合物，其猝灭过程为静态猝灭。

3.2 p-CA与HSA的结合常数及结合位点数

对于静态猝灭过程可用公式[18]计算结合常数(KA)及结合位点数(n)：

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]，

(3)

固定HSA浓度，改变p-CA的浓度，得到lg[(F0-F)/F] -lg[Q]曲线，拟合获得方程、结合常数和结合位点数，结果见表1。由表可知，p-CA与HSA 结合位点数n接近于1，表明HSA与p-CA相互作用只有1个结合位点。KA值随温度升高而降低，说明温度升高导致复合物稳定性降低，这进一步证明体系的猝灭过程为静态猝灭。结合常数KA值为104数量级，说明p-CA与HSA之间具有较强的结合作用。

表1 p-CA与HSA作用的猝灭常数KSV、结合常数KA、结合位点数n

3.3 p-CA与HSA结合位置

SystemK'A/(104L·mol-1)nRφ/%华法林3.170.480.9135-7.04布洛芬2.560.570.9233-24.9洋地黄毒苷2.410.590.9301-29.3

3.4 p-CA与HSA的作用力类型

氢键、疏水作用、范德华力和静电引力等是小分子与蛋白质间的主要结合力类型。由Van’t Hoff 定律[19]可计算得到反应体系的热力学参数：

(4)

(5)

当温度变化不大时，反应ΔH可看作常数，p-CA与HSA体系的热力学参数结果见表3。由热力学参数可判断p-CA与HSA作用力类型[20]。ΔH<0，ΔS>0，表明p-CA与HSA之间的作用力主要为静电引力，ΔG<0说明结合反应是自发进行。原因在于siteⅠ是一个正电荷残基包围的口袋，p-CA中含有酚基和羧基阴离子与siteⅠ空腔内碱性氨基酸残基间容易产生静电作用力。

表3 p-CA与HSA作用的热力学参数

3.5 p-CA与HSA的结合距离

根据Förster能量转移理论[16]有如下关系：

(6)

(7)

(8)

图2为HSA荧光发射光谱与p-CA吸收光谱的重叠图，结合公式(8)，将光谱重叠部分分割成极小的矩形面积求和，得到J=1.84×10-14(cm3·L)/mol。取向因子K2取荧光给体与受体随机分布的平均值2/3，溶剂的折射率N取水和有机物的平均值1.336，无受体存在时能量供体的荧光量子产率Φ取0.118，计算得到R0=2.71 nm。由R0和实验测得的E=0.022，获得能量给体与受体间的距离r=5.11 nm。r>R0，进一步证明p-CA对HSA的猝灭过程为静态猝灭[18]，与3.1节和3.2节结论一致。r<7 nm说明HSA与p-CA间存在非辐射能量转移[21]。

图2 HSA的荧光发射谱(a)和p-CA的吸收光谱(b) (T=298 K)

Fig.2 Fluorescence emission spectrum of HSA(a) and the absorption spectrum ofp-CA(b) (T=298 K)

3.6 p-CA对HSA构象的影响

对于蛋白质的同步荧光光谱，Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm分别只显示酪氨酸、色氨酸残基的荧光光谱特性。图3为p-CA-HSA体系的同步荧光光谱。可以看出，随着p-CA浓度的增加，Δλ=15 nm(a)和Δλ=60 nm(b)的荧光强度均呈显著下降趋势，但最大荧光发射峰波长无显著变化。即酪氨酸和色氨酸残基周围环境无明显变化，这表明p-CA的作用没有引起HSA构象的变化。

3.7 p-CA与HSA分子间结合状态

p-CA的理论拉曼光谱、NRS和SERS的比较研究是进一步分析p-CA与HSA分子间结合状态的前提和基础。我们应用B3LYP/6-311++(d,p)对p-CA进行结构优化和频率计算，在结果中未发现虚频的存在，说明优化得到的分子结构式是稳定的。优化后的p-CA分子结构如图4所示。

CHSA=1.0×10-6mol/L； 1～7:Cp-CA=(0, 1.0, 3.0, 5.0, 7.0, 10.0, 15.0)×10-6mol/L。

图3p-CA与HSA作用的同步荧光光谱(T=298 K)。(a) Δλ=15 nm；(b) Δλ=60 nm。

Fig.3 Synchronization fluorescence spectra ofp-CA and HSA(T=298 K). (a)Δλ=15 nm. (b)Δλ=60 nm.

3.7.1p-CA的理论拉曼光谱、NRS和SERS

图5显示的是p-CA理论拉曼光谱(曲线1)、固体粉末的NRS(曲线2)和其水溶液在银溶胶中的SERS(曲线3)。可以看出，p-CA的NRS和SERS峰位与理论计算拉曼光谱基本一致，主要基团的拉曼峰都存在，只是稍有偏移或强度的变化。

表4 p-CA的实测拉曼特征峰与理论计算值及其归属

表4(续)

aν:stretching;δ：in-plan bending;γ:out-of plane bending;σ：scissoring;ρ：wagging;ω：rocking;τ：torsion; as：asymmetric.

3.7.2p-CA与HSA作用的SERS

Fig.6 SERS of HSA andp-CA complexes in silver colloid with different concentration ratios

4 结 论

在模拟生理条件下，研究了不同浓度对-香豆酸(p-CA)与人血清白蛋白(HSA)作用的荧光光谱和表面增强拉曼光谱。阐明了p-CA对HSA的荧光猝灭机制为静态猝灭，并伴随有非辐射能量转移，推断p-CA分子以酚基通过静电引力方式与HSA的亚域ⅡA的SiteⅠ进行结合，两者间的结合作用较强，其结合常数为104数量级，结合位点数约为1，结合距离为5.11 nm。p-CA的加入没有导致HSA构象发生明显变化。此外，p-CA与HSA作用前后，均以—COO-与银纳米颗粒表面进行吸附，其吸附方式分别为垂直吸附和平行吸附。

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申炳俊(1977-)，男，吉林通化人，助理研究员，博士研究生，2007年于长春理工大学获得硕士学位，主要从事光谱分析理论与应用的研究。

E-mail: bjshen@cust.edu.cn田坚(1956-)，男，吉林长春人，教授，博士生导师，1996年于东北大学获得博士学位，主要从事激光与物质相互作用、能源科学技术与工程等的研究。

E-mail: tianjian@cust.edu.cn

Serum Albumin by Fluorescence and Surface Enhanced Raman Spectra

SHEN Bing-jun1, JIN Li-hong2, ZHANG Jia-jia2, LIU Rong-juan2, LIU Zhan-wei2, LIU Yu-xin2, CHAI Hao2, TIAN Jian1*

(1.LaboratoryofCleanEnergyTechnology,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China; 2.SchoolofLifeScienceandTechnology,ChangchunUniversityofScienceandTechnology,Changchun130022,China)

*CorrespondingAuthor,E-mail:tianjian@cust.edu.cn

Under simulated physiological conditions, the binding mechanism betweenp-Coumaric acid (p-CA) and human serum albumin (HSA) was investigated by fluorescence spectrum and surface enhanced Raman scattering (SERS). The results show that the effect betweenp-CA and HSA is a static fluorescence quenching with Förster’s non-radioactive energy transformation. At 298, 304, 310 K, the binding constants (KA) betweenp-CA and HSA are 3.41×104, 2.09×104, 1.38×104L/mol, the binding site (n) value is approximate to 1. SERS reveals that the phenolic group ofp-CA combines with HSA. Thermodynamic data indicate that the interaction betweenp-CA and HSA is mainly electrostatic attraction. Marker competition experiments point out that the primary binding site forp-CA is located at site Ⅰ in HSA. According to Förster energy transfer theory, the binding distance betweenp-CA and HSA is 5.11 nm. Synchronous fluorescence spectra show that the conformation of HSA does not changed apparently with the addition ofp-CA.

fluorescence spectrum; surface enhanced Raman scattering;p-Coumaric acid; human serum albumin; reaction mechanism

1000-7032(2016)10-1259-08

2016-04-18；

2016-08-04

国家自然科学基金(21153003)； 吉林省教育厅项目(201574)； 长春理工大学博士后基金(2014年)资助项目

O657.3

A

10.3788/fgxb20163710.1259