花背蟾蜍蝌蚪发育与甲状腺形态相关性研究

高凤娟 陆宇燕 戴美玲 李丕鹏

(沈阳师范大学两栖爬行动物研究所，辽宁省生物进化与生物多样性重点实验室，沈阳，110034)

花背蟾蜍蝌蚪发育与甲状腺形态相关性研究

高凤娟 陆宇燕 戴美玲 李丕鹏*

(沈阳师范大学两栖爬行动物研究所，辽宁省生物进化与生物多样性重点实验室，沈阳，110034)

花背蟾蜍；

(Institute of Herpetology and Liaoning Key Laboratory of Evolution and Biodiversity， Shenyang Normal University，Shenyang，110034，China)

甲状腺作为两栖动物主要的内分泌腺之一，在其变态发育过程中起着重要的调控作用[1]，而无尾两栖动物幼体-蝌蚪被认为是研究甲状腺功能理想的模式生物[2-3]。国内外学者对蝌蚪变态发育期的甲状腺形态结构、相关激素含量及其生理功能分别进行了研究[4-5]。近年来国内学者分别探讨了3种无尾两栖类蝌蚪在变态发育中主要发育期的生物学量度、甲状腺的分化时期、各发育期甲状腺组织结构和甲状腺激素之间的关系[6-8]，研究表明蝌蚪各项生物学量度与甲状腺滤泡大小和激素水平之间有着显著的关联性。另外，由于两栖类的繁殖特性以及蝌蚪外鳃和皮肤的高渗透性，水环境中任何化学物质均能通过仅由一层上皮细胞构成的外鳃和由2～3层细胞构成的皮肤[9]渗入体内导致对其各器官的损伤[10-11]，故两栖类的蝌蚪已被确定为环境变化的警示生物。

花背蟾蜍(Buforaddei)，隶属于无尾目(Anura)蟾蜍科(Bufonidae)蟾蜍属，是我国北方的广布种，也是生物学基础研究常用的实验动物之一[12-14]。虽然对花背蟾蜍的研究已有大量的报道[15-17]，但对其发育过程中甲状腺的演化及其与蝌蚪生长发育的关系尚未见报道。本文以花背蟾蜍为实验动物，选择变态发育中具有代表性的发育期，对蝌蚪相关生物学量度和甲状腺总面积、滤泡面积及滤泡上皮细胞高度等进行了测量及分析。旨在揭示变态发育中花背蟾蜍蝌蚪生长发育与甲状腺形态的关系，为花背蟾蜍生物学研究积累更多的科学资料，同时为水环境污染对花背蟾蜍蝌蚪发育的影响研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

抱对的花背蟾蜍采自沈阳北陵公园，带回实验室将其置于塑料整理箱内(长35 cm，宽26 cm)，加注曝气2 d的自来水3 cm高。待其产卵1 h后，选取一定数量已完成第一次卵裂的受精卵放置在水深10 cm左右的整理箱内饲养，孵化前水温为(22±1)℃(室温)，变态发育时期为(23±2)℃(室温)。隔天更换一次曝气2 d的自来水。待蝌蚪孵化开口后，以鱼食、鸡蛋黄、碎鸡肉和青菜等饲喂。

蝌蚪分期按Gosner[18]分期标准进行，自G26开始，进行隔期取材，共选取了11个发育期。

1.2 方法

1.2.1 蝌蚪生物学量度

将选定发育期的蝌蚪每期取10只，固定于10%的中性福尔马林溶液中待用。利用电子游标卡尺(桂林广陆电子数显游标卡尺，测量范围150 mm，精确度0.01 mm)测定蝌蚪体长(吻端至肛管基部)、尾长(肛管基部至尾末端)、眼间距(两眼间最短距离)、后肢长、尾肌高和尾肌宽(以蝌蚪尾基部为测量点)等数据。

1.2.2 甲状腺相关检测

将上述完成测量的蝌蚪，进行常规石蜡切片，连续切片，厚度7 μm，HE染色。利用Olympus BX-50研究用显微镜进行观察和照相，利用Image-Pro Express 6.0进行相关参数的测量。测量甲状腺面积时，选取甲状腺最大切面进行测量；测量滤泡面积时，在连续切片中选取该滤泡的最大切面进行测量。由于G28～G32蝌蚪甲状腺滤泡较少，测量所有滤泡最大横切面面积并进行降序排列，选取面积偏大的1/3作为大型滤泡，选取面积偏小的1/3作为小型滤泡，中间1/3即为中间型滤泡；G34～46蝌蚪由于滤泡数量较多，大型滤泡为面积大于2 500 μm2，中型滤泡为面积在800 μm2与2 500 μm2之间，小型滤泡面积为小于800 μm2，统计不同类型的滤泡数量，并测量相应滤泡的上皮细胞高。

1.2.3 实验数据分析

利用SPSS22.0进行单因素方差分析和Pearson相关性系数分析。生长速率计算公式：生长速率=((发育期B-发育期A)/发育期A)×100%，例如：G30-G28生长速率=((G30-G28)/G28)×100%。

2 结果

2.1 花背蟾蜍蝌蚪变态发育各期生物学量度和生长速率比较

2.1.1 花背蟾蜍蝌蚪体长的发育

图1 花背蟾蜍蝌蚪变态过程中体长、尾长和后肢长的变化Fig.1 Changes of body length，tail length and hind limb length in Bufo raddei tadpoles during metamorphosis

由图1可见：花背蟾蜍蝌蚪体长发育可分为快速生长期(G26～G28)、生长期(G28～G42)和生长调整期(G42～G46)3个阶段，其中快速生长期的生长速率(表1)达到90.37%，而生长调整期生长速率呈负值。体长在G38为最大值；在G44时，体长与后肢长在数值上非常接近，其长度分别为10.79 μm和10.95 μm。2.1.2 花背蟾蜍蝌蚪尾的发育尾长的发育可分为快速生长期(G26～G28)、生长期(G28～G42)和衰减期(G42～G46)。其中快速生长期的生长速率达到了93.28%，进入G42之后尾部生长速率均呈负值。

2.1.3 花背蟾蜍蝌蚪后肢的发育

后肢芽发育可分为5个阶段，缓慢生长期(G26～G34)、快速增长期(G34～G38)、急速生长期(G38～G40)、稳定生长期(G40～G44)和补充生长期(G44～G46)。在急速生长期的两个发育期中，后肢长度的生长速率达到了170.45%，高于缓慢生长期中生长速率最高的G26～G28(100%)和快速生长期的G34～G36(107.64%)。

表 1 花背蟾蜍变态发育中各期间的生长速率(%)

Tab.1 Growth rate of various stages during metamorphosis of Bufo raddei tadpoles(%)

2.1.4 花背蟾蜍蝌蚪眼间距、尾肌高和尾肌宽的变化

由图2可见：眼间距、尾肌高和尾肌宽均在G38时达到最大值，且在G44时尾肌高和眼间距在数值上非常接近。其中，眼间距在蝌蚪发育中可分为快速生长期Ⅰ(G26～G30)、稳定期(G30～G34)、快速生长期Ⅱ(G34～G38)和递减期(G38～G46)。快速生长期Ⅰ中最高生长速率达57.89%。尾肌发育包括尾肌高和尾肌宽2个数值，两个均可分为生长期(G26～G38)和衰减期(G38～G46)。尾肌高在达到最大值的G38后，即开始了其的衰减进程；而尾肌宽的衰减起点也是G38，但其出现明显的衰减时从G42开始。

图2 花背蟾蜍蝌蚪变态过程中眼间距、尾基高和尾基宽的变化Fig.2 Changes of interorbital distance，tail muscle height and tail mu-scle width in Bufo raddei tadpoles during metamorphosis

2.2 甲状腺及滤泡的相关测量

2.2.1 甲状腺及滤泡面积的变化

在对石蜡切片的观察中发现，G26蝌蚪部分可见甲状腺的存在，而其又被大量的色素细胞覆盖，仅隐约可见滤泡(图3)，因此没有此期相关的测量数据。G28蝌蚪(图3)可见清晰的甲状腺及其滤泡。随着蝌蚪发育进程的推进，甲状腺面积快速增大，至G42时达到峰值(图4-1)，随后呈缓慢下降的趋势。大型甲状腺滤泡(即大滤泡)和中型甲状腺滤泡(即中滤泡)的变化与甲状腺整体面积变化的趋势相符。而在甲状腺整体面积增大中，大滤泡的贡献占绝对优势，其次是中滤泡，且这两种滤泡均在G42时出现面积的峰值。小型甲状腺滤泡(即小滤泡)虽然对甲状腺面积的增加没有明显的贡献，但也有着其自身的变化规律，在G32和G40分别出现了一小一大的面积峰值(图4-2)。G40峰值的出现较大、中滤泡提前了两个发育期，之后在G44～G46期间出现了一个明显的面积增长的趋势，此期间中滤泡面积呈平稳状，而大滤泡却呈明显的面积缩减趋势。

1，2.G26 3.G28 4.G36 5.G42 6.G46图3 花背蟾蜍蝌蚪变态过程中甲状腺形态Fig.3 Morphology of throid gland of Bufo raddei tadpoles during metamorphosis

图4-1 花背蟾蜍蝌蚪变态发育过程中甲状腺和滤泡面积的变化Fig.4-1 Changes of thyroid gland area and follicle area in Bufo raddei tadpoles during metamorphosis

图4-2 花背蟾蜍蝌蚪变态发育过程中小滤泡面积的变化Fig.4-2 Changes of small follicle area in Bufo raddei tadpoles during metamorphosis

2.2.2 甲状腺滤泡数量变化

随着蝌蚪的发育，甲状腺不仅在面积呈现快速的增长，其滤泡总数量以及不同大小滤泡的数量也不断增多，而在G42之后甲状腺面积和滤泡数量随之呈现降低趋势。以不同大小滤泡的数量作百分比图(图5)可见，大滤泡在G28和G34最多，分别为滤泡总数的47%和49%，G36～G46时次之，占总滤泡数的27%～35%之间，而G30和G32最少仅为12%和16%。中滤泡数量在G30和G32最多，分别占总滤泡的53%和49%，在G28、G34～G40和G44时滤泡总数的30%～39%之间，G42时最少，仅占23%。小滤泡在G42时最多，约占总滤泡的50%，G38、G40和G46次之，占总滤泡数量的41%和45%，G30、G32和G44分别占总滤泡数的35%、36%和34%，而在G28和G34时最少，仅为滤泡总数的13%。

图5 花背蟾蜍蝌蚪变态发育过程中不同大小滤泡比例变化Fig.5 Changes of the ratio of follicles of different sizes in Bufo raddei tadpoles during metamorphosis

图6 花背蟾蜍蝌蚪变态发育过程中滤泡上皮细胞高度的变化Fig.6 Changes of epithelia height in Bufo raddei tadpoles during metamorphosis

表2 花背蟾蜍蝌蚪变态发育中部分参数间相关性系数

注：*表示数据间相关性显著(P< 0.05)，**表示数据间相关性极显著(P<0.01)

Note：*indicate significant correlations between data(P<0.05)，**indicate extremely significant correlations between data(P<0.01)

总之，甲状腺中不同大小滤泡数量所占比例最高为53%(G30的中滤泡)，最低是12%(G34的小滤泡)。在3种滤泡中，中滤泡数量所占的比例变化相对平稳。

由图6可见，在G28，甲状腺中不同大小滤泡的滤泡上皮细胞高度较为接近，其间无显著性差异(P>0.05)；在G30，不同大小滤泡的滤泡上皮细胞高度呈现出明显的区分，大滤泡细胞高度最大，中等滤泡细胞高度仅为大滤泡细胞高度的70.54%，小滤泡的细胞高度仅是大滤泡细胞高度的50.6%，是其自身G28的68.66%，三者之间具有显著性差异(P<0.05)；G30以后仅在G34、G40、G44和G46等4个发育期时，大滤泡和中滤泡的细胞高度无显著性差异(P>0.05)，其他各期3种滤泡细胞高度均有显著性差异(P<0.05)。从滤泡上皮细胞高度变化趋势看，3种大小不同的滤泡细胞高度变化存在一定的协同性，在G28～G30期间，大滤泡细胞高度呈增长趋势，而中、小滤泡细胞高度却呈下降趋势；G32～G34时，3种滤泡细胞高度均呈增高趋势；在G34～G38期间，中滤泡和小滤泡的细胞高度均呈下降趋势，而大滤泡在G36时出现了一个次峰值；在G38～G40期间，3种大小的滤泡均呈上升的趋势；在G40～G46变态高峰期间，大、中滤泡细胞高度在G42达到各自的峰值，随即下降，而小滤泡在此期间细胞高度的变化正好与大中滤泡相反，在G42时，细胞高度呈一个低点，随即在G44出现了仅低于G28的峰值，而此时大中滤泡的细胞高度均呈下降趋势。

2.3 相关性分析

选取了蝌蚪发育的3个关键性时期，将甲状腺面积、不同大小滤泡面积、滤泡上皮细胞高度分别与蝌蚪的体长、尾长、尾肌高、尾肌宽、眼间距和后肢长等进行了相关性分析。结果显示：G36时，甲状腺面积仅与眼间距、尾肌宽之间具有极显著的相关性，而与体长、尾长、尾肌高和后肢长之间没有相关性；不同大小的滤泡面积与6个蝌蚪的生物学量度值之间均为相关性极显著。甲状腺滤泡上皮细胞高与6个生物学量度之间的相关性，除小滤泡上皮细胞高与眼间距之间为相关性显著外，其余均为相关性极显著。G42时，除甲状腺面积与尾长之间的相关性显著，其他参数之间均为相关性极显著；除小滤泡上皮细胞高与尾肌宽之间为相关性显著外，其他参数之间均呈相关性极显著。G46时，除甲状腺面积与后肢长之间为相关性显著外，其他参数之间均为相关性极显著。

3 讨论

国内外对两栖类幼体-蝌蚪的变态发育过程有大量的报道[19-22]，其中也有对蝌蚪各时期相关生物学量度的记录[6-7，23-24]。本文研究结果显示，花背蟾蜍的体长、眼间距、尾肌高和尾肌宽在G38达到最大值，与中国林蛙(Ranachensinensis)[7]一致。尾长在G42达到最大值，与中国林蛙和中华蟾蜍(Bufogargarizans)[6]一致。由此可见，两栖类蝌蚪的发育特征表现出很大的相似性。值得注意的是：变态初期蝌蚪眼位于头上方近两侧，眼间距随着头部的发育变大而逐渐变大，在G38时达到最大值。随后蝌蚪的头部继续发育增大，但眼间距却出现了明显缩小，提示在G38之后，蝌蚪的眼就开始了向头正中线位置的移动，启动了向成蛙两眼位于头部近中央位置的移动程序。G38～G40后肢长度出现急剧增加，尾肌高和尾肌宽也在G38期达到最大值后随即呈下降趋势。那么就可以推断，G38是蝌蚪变态发育的一个转折期，之前是蝌蚪水中生活最佳时期，各器官处于快速生长期，之后各器官进入为了适应陆地生活的重建期。这个测量结果进一步验证了McDiarmid和Altig将蝌蚪变态发育划分为4个阶段，即变态前期(pre-metamorphosis，G27～37)、临近变态期(pro-metamorphosis，G38～39)、变态高峰期(metamorphosis climax，G40～45)和变态完成期(complete metamorphosis，G46)[25]的正确性。花背蟾蜍蝌蚪尾长在G42达到最大值后随即出现快速衰减，而尾肌高和尾肌宽虽然均在G38达到最大值后缩小，但两者的快速衰减却分别出现在G42、G44。可以推测在G42前肢伸展出来的同时肺呼吸开始启动，而此时四肢的登陆功能尚未健全，需要有强劲有力的尾作为支撑，辅助其初始的登陆过程，完成由水到陆的蜕变。

甲状腺体积、滤泡体积和滤泡上皮细胞高度与甲状腺功能有着密切关系，尤其是滤泡细胞高度可以作为判断甲状腺功能的指标[26]。两栖类的变态发育及其发育时程均受甲状腺激素的调控[27-28]，其中蝌蚪发育时程的长短与甲状腺机能峰值出现在哪个发育期有着明显的相关性[26]。花背蟾蜍蝌蚪甲状腺面积，大型和中型滤泡面积及其滤泡上皮细胞高度的最大值均出现在G42，与幼体期相对较短的物种如日本蟾蜍(BufoJaponicus)、棕色锄足蟾(Pelobatesfuscus)[29-30]、中国林蛙和中华蟾蜍一致[6-7]，早于黑斑侧褶蛙(Pelophylaxnigromaculatus)、树蛙(Rhacophorusarboreus)和黄条背蟾蜍(Bufocalamita)，它们甲状腺机能峰值出现在尾部开始退化时的G43[8，30-31]，更早于在G44-G45尾退化后期甲状腺功能才达到峰值的牛蛙(Lithobatescatebeianus)[32]。就甲状腺分化时间而言，黑斑侧褶蛙蝌蚪[8]是最早的，在G26即可观察到清晰的滤泡结构，且滤泡腔内有明显的胶质存在。花背蟾蜍蝌蚪虽然在G26大部分可见滤泡结构，但腔内仍无胶质存在。而中华蟾蜍蝌蚪[6]在G28时才能分辨甲状腺滤泡，但腔内无胶质；中国林蛙[7]最迟，在G33可分辨出甲状腺滤泡，且腔内已有胶质存在。黑斑蛙出现胶质最早，即甲状腺功能的构建完成最早，而其功能的峰值出现比花背蟾蜍等4种蝌蚪均晚，是否与黑斑侧褶蛙蝌蚪个体体积大，各种器官的重建任务重有关有待于进一步研究。

另外，虽然在中国林蛙和中华大蟾蜍蝌蚪甲状腺演化的研究中均观察到了甲状腺滤泡存在着大小差异，但均未给出详细数值的报道。本研究结果显示，花背蟾蜍蝌蚪甲状腺在G28即可区分大、中、小3种大小的滤泡，虽然在此期不同大小滤泡面积还没有呈现明显的差异(P>0.05))，但在G30时3者间即出现了显著性差异(P<0.05)，更加值得注意的是，在不同发育期中，不同大小滤泡的数量比例和面积大小上均呈现了特有的变化趋势，尤其是小滤泡面积变化与大、中滤泡及甲状腺整体面积的变化趋势相异。是否提示了不同大小滤泡在甲状腺激素分泌方面有着隐含的特点，有待于进一步探究。

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Buforaddei；

Studies on the Relationship Between the Development of Buforaddei Tadpoles and the Morphology of the Thyroid Gland

Gao Fengjuan Lu Yuyan Dai Meiling Li Pipeng*

To describe the relationship between tadpole and thyroid gland morphology inBuforaddeitadpoles during metamorphosis，we recorded morphometrics of tadpoles(body length，tail length，interorbital distance，tail muscle height，tail muscle width and hind limb length).In addition，the thyroid gland area，the follicle areas of different sizes and the epithelia height were measured by histological methods.We selected three key stages，viz.G36，G42 and G46，in tadpole development，then analyzed correlations between thyroid area，follicle area，epithelia height and the six morphometric indices.Body length，internasal space，tail muscle height and tail muscle width reached their respetive maxima in stage G38.Tail length reached its maximum value in stage G42.The length of the hind limb grew fastest during G38-G40.Tail length and tail muscle height showed rapid attenuation at the beginning of G42，tail muscle width showed rapid attenuation during G44.The thyroid gland，the large follicles and medium follicles reached a maximum in G42 and then decreased.Small follicles reached their maximum in G40 then decreased，and rose again in G44.Correlation analysis showed that only the small follicle epithelia height was significantly correlated with internasal space in G36 and tail muscle width in G42.All other correlations were highly significant.Only thyroid gland area was not significantly correlated with body length，long hind legs，tail length and tail muscle height in phase G36.Thyroid gland area was significantly correlated with tail length in G42 and with hind limb length in G46.All other correlations were highly significant.

稿件运行过程

2016-06-12

修回日期：2016-06-30

发表日期：2016-11-10

蝌蚪；

生物学量度；

甲状腺

Tadpole；

Biological measurements；

Thyroid gland

Q959.5 Q954.2

A

2310-1490(2016)04-363-07

为了探究花背蟾蜍蝌蚪变态发育期间主要生物学量度与甲状腺形态的关系，本研究测量了蝌蚪主要发育期的各项生物学量度(体长、尾长、眼间距、尾肌高、尾肌宽以及后肢长等)，并利用组织学方法测量了花背蟾蜍蝌蚪甲状腺面积，不同大小滤泡面积及其滤泡上皮细胞高度，选择蝌蚪发育3个关键期G36、G42和G46，将6个蝌蚪生物学量度和甲状腺面积、滤泡面积和滤泡上皮细胞高度进行相关性分析。结果显示：体长、眼间距、尾肌高和尾肌宽在G38达到最大值，尾长在G42达到最大值；后肢长在G38～G40增长最快；尾长和尾肌高在G42开始快速衰减，尾肌厚在G44才快速衰减。甲状腺、大滤泡和中滤泡面积在G42达到最大值，而后呈下降趋势；小滤泡面积在G40达到最大值之后下降，在G44再次上扬。相关性分析结果显示：在滤泡上皮细胞高度方面，仅小滤泡上皮细胞高在G36与眼间距、在G42与尾肌宽为相关性显著，其他均为相关性极显著。在甲状腺及滤泡面积方面，仅甲状腺面积，在G36时与体长、后肢长、尾长和尾肌高间相关性不显著；与G42尾长、G46后肢长间相关性显著，其他均为相关性极显著。

国家自然科学基金项目资助(30870276)

高凤娟，女，26岁，硕士研究生；主要从事两栖爬行动物环境毒理学研究。E-mail：279324525@qq.com

*通讯作者：李丕鹏，E-mail：lipipeng@yahoo.com