大黄总蒽醌对大鼠睾丸支持细胞增殖及Cyt-C、Caspase3表达的影响*

杨 宵，佟继铭，万慧杰，赵盼盼，董雅洁，张树峰

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

大黄总蒽醌对大鼠睾丸支持细胞增殖及Cyt-C、Caspase3表达的影响*

杨 宵，佟继铭，万慧杰，赵盼盼，董雅洁，张树峰△

（河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

目的：探讨大黄总蒽醌（RTA）含药血清对大鼠睾丸支持细胞（SC）增殖及细胞色素C（Cyt-C）、Caspase3表达的影响。方法：两步酶消化法分离培养大鼠SC细胞，第三代SC细胞随机分为空白对照组和3个RTA含药血清组，分别以胎牛血清和RTA含药血清作用48h后，MTT法观察SC细胞的增殖活力，Western blotting法检测SC细胞Cyt-C、Caspase3蛋白的表达情况。结果：与空白对照组比较，RTA高剂量组含药血清（4.50g/kg）SC细胞增殖活力明显降低（P＜0.05），Cyt-C、Caspase3蛋白表达明显升高（P＜0.05）；RTA中剂量组含药血清（2.25g/kg）可显著抑制SC细胞增殖，上调Caspase3蛋白表达水平（P＜0.05）。结论：RTA中、高剂量组含药血清可抑制大鼠SC细胞增殖，其机制可能与调节Cyt-C和Caspase3蛋白表达有关。

大黄总蒽醌；睾丸支持细胞；细胞增殖；Cyt-C；Caspase3

大黄为常用中药，因药效肯定被广泛应用于临床。近年来，大黄在美容养颜、排毒瘦身等方面的应用，使得人们对大黄的使用趋向长期化，相关不良反应报道频发［1］。大黄的主要活性成分为蒽醌类化合物，本课题组前期体内实验研究发现，大黄总蒽醌（RTA）可明显降低大鼠睾丸指数和精子数量［2］。本研究拟采用RTA含药血清体外培养大鼠睾丸支持细胞（SC），观察RTA对SC细胞增殖及Cyt-C、Caspase3表达的影响，完善RTA影响雄性大鼠生殖的相关实验研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物：8周龄SD大鼠32只，16-22日龄SD大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2012-0001）。

1.1.2 药材与试剂：大黄总蒽醌（南京泽朗医药公司，纯度54.7%，批号：ZL140906582）；胰酶、胶原酶Ⅳ、DMEM/ F12培养基，美国Gibco公司。Cyt-C一抗，英国Abcam公司；Caspase3一抗、羊抗鼠二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 RTA含药血清的制备 32只SD大鼠随机分为空白对照组，RTA低、中、高剂量组，每组8只。RTA组大鼠分别给予不同剂量的RTA（0.45g/kg、2.25g/kg、4.50g/ kg）灌胃，空白对照组大鼠灌胃给予同等剂量的生理盐水，各组大鼠均每日灌胃1次，连续给药7天。各组大鼠末次给药1h后，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3500r/ min离心10min，分离血清，过滤除菌，56℃灭活30min，即得各RTA组含药血清，-70℃保存。

1.3 大鼠SC细胞的培养 16-22天SD大鼠，脱颈椎处死，无菌环境取出睾丸，剥离被膜、血管，PBS冲洗，剪碎。0.25%胰酶37℃消化12min，至睾丸组织呈絮状，加入培养液终止消化，离心去除胰酶；0.5%胶原酶Ⅳ 37℃消化15min，培养液终止消化，去除胶原酶。加入培养液调整细胞浓度为1×105/ml，100目钢网过滤去除未消化完全的组织，滤液加入培养皿，37℃、5% CO2培养箱培养，48h后更换培养液。细胞生长至75%以上时传代培养。

1.4 RTA含药血清对大鼠SC细胞增殖的影响 第3代SC细胞以1×105/ml接种于96孔板，分为空白对照组和3个RTA含药血清组，每组8个复孔。普通培养液培养48h，弃上清，分别加入空白和低、中、高剂量RTA含药血清进行培养，37℃、5% CO2培养箱培养48h。MTT法检测，570nm处测定吸光度A值。

1.5 Western blotting法检测大鼠SC细胞Cyt-C、caspase3蛋白表达第3代SC细胞1×105/ml的密度接种至培养皿，普通培养48h后含药血清处理（分组及给药方法同1.4），37℃、5%CO2培养箱培养24h后，加入细胞裂解液，细胞刮提取蛋白。采用5%浓缩胶、12%分离胶进行凝胶电泳，蛋白上样量30 μ g；电泳后转膜，封闭过夜；一抗孵育2h，Caspase3（1：1000）、Cyt-C（1：2000）、β-actin（1：3000）；二抗孵育1.5h；ECL超敏发光液显影成像。胶片扫描后应用Quantity One 4.6.2软件进行数据分析，以目的条带与β-actin条带灰度值的比值作为目的蛋白表达的相对水平。

1.6 统计分析 应用SPSS 17.0软件进行数据处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RTA含药血清对SC细胞增殖的影响 RTA高剂量组SC细胞增殖活力明显低于空白对照组和RTA低、中剂量组（P＜0.05）；RTA中剂量组SC细胞增殖活力明显低于空白对照组和低剂量组（P＜0.05）；其余组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见附表。

2.2 RTA含药血清对SC细胞Cyt-C、Caspase3蛋白表达的影响 RTA高剂量组SC细胞Cyt-C、Caspase3蛋白表达水平显著高于空白对照组和低、中剂量组（P＜0.05）；RTA中剂量组SC细胞Caspase3蛋白表达水平明显高于空白对照组和低剂量组（P＜0.05）；其余组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见附表、附图。

附表 SC细胞增殖和Cyt-C、Caspase3蛋白表达情况（±s，n=8）

附表 SC细胞增殖和Cyt-C、Caspase3蛋白表达情况（±s，n=8）

与空白对照组比较：*P＜0.05；与RTA低剂量组比较：#P＜0.05；与RTA中剂量组比较：△P＜0.05

组别RTA剂量（g/kg）吸光度值（A）Cyt-CCaspase3 0.450.31±0.020.90±0.620.93±0.05 2.250.30±0.02*#0.93±0.101.04±0.10*#4.500.28±0.02*#△1.08±0.17*#△1.26±0.12*#△空白对照组---0.32±0.010.89±0.090.86±0.04低剂量组中剂量组高剂量组

附图 大鼠SC细胞Caspase3、Cyt-C蛋白表达情况

3 讨论

大黄是临床上用来治疗慢性肾功能衰竭非常常用的中药，其中所含的蒽醌类成分，如大黄素可延缓肾功能衰竭的进展［3］。RTA约占大黄生药材的2%-5%，主要为大黄酸、大黄素、芦荟大黄素等［4］。有关蒽醌类化合物安全性的研究指出，长期使用含蒽醌的植物性泻药会造成大肠黑变病（MC），大鼠肝肥大，肾小管生成透明小滴，肾矿化等，机制除RTA可直接作用细胞产生毒性外，还涉及细胞凋亡途径［5-6］。目前已知的凋亡信号传导途径有三条：Fas介导的细胞凋亡途径、线粒体凋亡途径和内质网应激［7］。Cyt-C存在于线粒体内膜的外面，凋亡因素作用于线粒体后，线粒体释放Cyt-C，激活胞质中的caspase9，进一步激活caspase3，诱导细胞凋亡［8］。

睾丸是男性重要的生殖器官，SC是生精细胞的支架，为生精细胞提供必需的营养物质和生长因子，如激活素、白介素、生精生长因子等［9］。SC细胞的活力直接决定生精细胞能否得到足够的营养和支持，进而决定精子的数量与活力，反应机体的生育能力。本研究发现，RTA中、高剂量组含药血清可明显抑制SC细胞增殖，RTA高剂量组含药血清可明显上调SC细胞Cyt-C和Caspase3蛋白的表达。

本研究提示，RTA中、高剂量组含药血清可抑制大鼠SC细胞增殖，其作用机制可能与调节Cyt-C、Caspase3蛋白的表达有关。

［1］胡晓丞，李亚洲，张树峰，等.大黄水提物对雄性小鼠睾丸影响的实验研究［J］.承德医学院学报，2012，29（1）：18-20.

［2］郭建恩，胡晓丞，佟继铭，等.大黄水提物对雄性未成年大鼠生殖毒性的实验研究［J］.上海中医药杂志，2013，47（12）：82-86.

［3］Kuo YC， Tsai WJ， Meng HC， et al. Immune reponses in human mesangial cells regulated by emodin from Polygonum hypoleucum Ohwi［J］. Life Sci， 2001， 68（11）: 1271-1286.

［4］匡海学.中药化学［M］.北京：中国中医药出版社，2003.94-95.

［5］Byers RJ， Marsh P， Parkinson D， et al. Melanosis coli is associated with an increase in colonic epithelial apoptosis and not with laxative use［J］. Histopathology， 1997， 30（2）: 160-164.

［6］National Toxicology Program. NTP Toxicology and Carcinogenesis Studies of EMODIN （CAS N0:518-82-1）Feed Studies in F344/N Rats and B6C3F1 Mice［J］. Natl Toxicol Program Tech Rep Ser，2001， 493: 1-278.

［7］朱炎杰，高维娟.Cyt-C与caspase在细胞凋亡中的作用及相互关系［J］.中国老年学杂志，2011，31（15）：2990-2992.

［8］李云，刘菲.Cyt-C和Caspase3在STZ诱导糖尿病大鼠晶状体上皮细胞中的表达［J］.眼科新进展，2014，34（3）：228-231.

［9］张静，张晨，黄云飞.吸烟对雄性小鼠睾丸组织中增殖细胞核抗原表达的影响［J］.毒理学杂志，2011，25（2）：163-165.

（基础医学栏目编辑：陈志宏）

EFFECTS OF RHEUM TOTAL ANTHRAQUINONE ON PROLIFERATION AND CYT-C, CASPASE3 EXPRESSION IN SERTOLI CELLS

YANG Xiao， TONG Ji-ming， WAN Hui-jie， et al
(Hebei Key Laboratory of Research and Exploitation of Traditional Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To explore the effects of rheum total anthraquinone （RTA）-containing serum on proliferation and Cyt-C， Caspase3 expression of Sertoli cells. Methods: Two step enzyme digestion method was used to isolate Sertoli cells of SD rats； The third generation of Sertoli cells were randomly divided into blank control group and 3 RTA-containing serum groups. MTT was used to observe the proliferation of Sertoli cells， Western blotting to detect Cyt-C and Caspase3 expression in Sertoli cells after the Sertoli cells were treated with fetal calf serum and RTA-containing serum for 48h respectively. Results: Compared with blank control group， the proliferation activity of Sertoli cells in high dose RTA-containing serum group （4.50g/kg） obviously declined， Cyt-C and Caspase3 expression in Sertoli cells obviously increased（P＜0.05）. Middle dose RTA-containing serum （2.25g/kg） could obviously inhibit proliferation of Sertoli cells and obviously increase Caspase3 expression in Sertoli cells （P＜0.05）. Conclusions: High dose and middle dose RTA-containing serum can inhibit proliferation of rats' Sertoli cells， which maybe related to regulating expression of Cyt-C and Caspase3.

Rheum total anthraquinone； Sertoli cell； Proliferation； Cyt-C； Caspase3

* 河北省教育厅资助项目（2009301）

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R285.5

A

1004-6879（2016）03-0189-03

（2015-11-11）