Aβ寡聚体对海马神经细胞突触形态及突触蛋白Ng表达的影响①

尉荣翠，房迎华，赵秀琴，张道春，黄昕艳

(佳木斯大学第二附属医院，黑龙江 佳木斯 154002)



Aβ寡聚体对海马神经细胞突触形态及突触蛋白Ng表达的影响①

尉荣翠，房迎华，赵秀琴，张道春，黄昕艳

(佳木斯大学第二附属医院，黑龙江 佳木斯 154002)

目的：研究Aβ25-35寡聚体对原代培养海马神经细胞突触形态及突触蛋白Ng表达的影响。方法：5、10、20umol/L Aβ25一35寡聚体作用于原代培养的海马神经元1h，以免疫细胞化学法检测Ng的表达。结果:与对照组相比:10、20μmol/L Aβ25-35寡聚体致Ng表达减少,差异有显著性(P<0.05，P<0.01)，以10μmol/L Aβ25-35组最显著(P<0.01)。结论：Aβ25-35寡聚体对突触有损伤作用与作用浓度有关。

Aβ25-35 寡聚体；原代培养；Ng

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以进行性认知功能减退为特征的神经变性疾病，众多的研究认为，其典型的病理学改变老年斑(senile plaque,SP) 的主要成分β-淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)是该病发病的起始因素和关键环节[1]，Aβ聚集后损伤突触、激活胶质细胞和星形细胞、损伤神经元、最终导致痴呆。最近有研究表明，Aβ在形成纤维性沉积前的中间体状态即Aβ寡聚体(oligomers)亦可产生神经毒性作用，且发现在AD发病早期还未出现明显的老年斑之前，其认知功能的减退与可溶性Aβ水平及突触功能障碍密切相关[2、3]，Aβ引起毒性的必需结构是其25-35位的氨基酸残基序列(即Aβ25-35)。但是,Aβ25-35诱导的神经细胞损伤机制还不清楚。本研究利用寡聚体Aβ25-35作用于原代培养的海马神经细胞建立AD细胞模型，观察Aβ25-35 寡聚体对海马神经细胞的突触蛋白神经颗粒素(Neurogranin， Ng)表达的影响，以期对AD早期的发病机制有进一步的认识。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

六氟异丙醇(HFIP)、无酚红F12购自Sigma公司，B27添加剂、DMEM/F12、胎牛血清购自Gibco，Ng及Aβ25-35均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Aβ25-35寡聚体的制备：将Aβ25-35肽从-20℃冰箱取出放在冰上，在通风橱内将HFIP放在冰上预冷，每1mg Aβ25-35加入220μLHFIP，盖上离心管盖在室温放置60min，Aβ25-35充分溶解后放回冰上10min，再将Aβ25-35-HFIP溶液放置室温下挥发、过夜。次日再置于通风橱内使HFIP挥发殆尽(约2h)。每管加44μLDMSO，吹打混匀后，每管加9386μLF12培养基，4℃孵育24h，4℃，14000rpm离心10min后，转移上清液至新管，分装，放入-20℃，储存浓度为100μmol/L。

1.2.2 海马神经细胞的原代培养：选用出生3d内的Wistar大鼠，解剖分离出海马，经0.125%胰酶于37℃培养箱中消化8～12min，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化。经悬浮、离心、过滤等步骤收集细胞,用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基制成细胞密度为5×105个/mL的单细胞悬液,接种于预先铺有多聚赖氨酸的24孔培养板内的盖玻片上，置于37℃， 5%CO2培养箱中培养，24h后换含2%B27的DMEM/F12培养基，每隔3d半量换液1次。

1.2.3 实验分组及Aβ25-35寡聚体干预:海马神经细胞培养7d后，弃原培养液，加入DMEM培养液及Aβ25-35寡聚体。实验分为三组，使Aβ25-35寡聚体的终浓度分别为5、10、20μmol/L，同时设不加Aβ25-35寡聚体的对照组(以相应体积的DMEM培养液代替)，每组设8孔，1h后终止培养，进行免疫细胞化学染色。

1.2.4 免疫细胞化学染色:4%多聚甲醛固定10min，PBS洗涤后,加入0.3% Triton X-100，PBS洗涤，滴加0.3%H2O2甲醇30min，5%正常马血清室温封闭60min。加入一抗Ng (1∶200，阴性对照以PBS代替),室温反应2h后入4℃冰箱过夜。次日PBS洗涤后加入生物素化二抗工作液山羊抗兔IgG，PBS洗涤后滴加辣根酶标记链霉卵白素，PBS洗涤后常规梯度乙醇脱水，DAB显色，二甲苯透明，封片。

1.3 图像分析与统计处理

倒置显微镜下，以胞浆内有棕黄色颗粒沉着为阳性细胞。在200倍镜下分别计数5个孔各5个视野的阳性细胞数和总细胞数，计算阳性细胞的百分比，以此代表神经元纯度。倒置显微镜下(LEICA DM4000 B)采集图像，进行灰度定量分析(Leica Qwin V3)，平均灰度值1～255(白色平均灰度值为255，黑色平均灰度值为0)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠海马神经细胞原代培养形态学观察

倒置相差显微镜下观察，接种24h后，几乎全部细胞己贴壁，可见光滑的突起。第3天，神经细胞胞体增大，突起延长并出现分枝，胞体呈三角形或椭圆形；第5天，神经细胞胞体进一步增大，突起继续增粗增长，末端分叉明显，己交织成网，胞体和突起晕光明显，立体感强;第7天，神经细胞生长旺盛，胞体大，突起长,分枝连接成网，见图1。

图1 原代海马神经细胞培养7d(×200)

2.2 Aβ寡聚体不同浓度组致伤原代培养海马神经细胞的形态学观察

实验第一部分：分别以5、10、20μmol/L浓度的Aβ25-35与神经细胞共同培养1h后镜下观察发现，10μmol/L组的细胞数目明显减少，大部分神经元胞体缩小，细胞间出现明显空隙，突起数目减少，断裂或消失，并可见到少量细胞碎片。20μmol/L浓度的Aβ组细胞突起消失，细胞胞膜已破裂，有很多细胞碎片，PBS冲洗后，碎片脱落，无法做免疫细胞化学染色。

2.3 Aβ寡聚体不同浓度组对Ng表达的影响

实验第二部分：正常对照组，棕黄色细胞多，被染色的细胞多为胞体较大，突起长，树突多处可见棕黄色颗粒(图2)。与正常对照组相比，Aβ 5μmol/L 组着色细胞无明显减少，突起较长，平均灰度值略有增大，Ng表达略有减少，但差异无显著性(P﹥0.05) (图3)；Aβ 10μmol/L 组着色细胞减少，被染色的细胞多为胞体较小，突起较短(图4)，Aβ 20μmol/L 组细胞明显减少，残存细胞胞体小，突起断裂、消失(图5)。Aβ 10μmol/L、20μmol/L 组灰度值增大，Ng表达减少，差异有显著性(P<0.01)；其中，Aβ 10μmol/L 组最明显，与Aβ 5μmol/L 组比较(P<0.01)，差异具有统计学意义。Aβ引起的PSD-95减少具有剂量依赖性，以Aβ10μmol/L为致突触损伤的适宜浓度见表1。

图2 正常对照组Ng(×400)

图3 5μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng(×400)

图4 10μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng(×400)

图5 20μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng(×400)

组别灰度值正常对照组239.35±0.31Aβ5μmol/L组239.48±0.28#Aβ10μmol/L组240.06±0.24*Aβ20μmol/L组252.71±0.23*

与正常对照组比较﹟P>0.05，*P<0.01；10μmol/L组与5μmol/L组比。

3 讨论

目前认为，Aβ在大脑皮层内的蓄积是AD病理发生过程中的一个早期必然事件，超前于其它脑区损伤和临床症状数年[4]。然有大量的证据显示Aβ纤维发挥了多种对神经元的毒性，然而最近有研究表明，Aβ由可溶状态到不溶状态的转变是AD发病机制中的关键环节，Aβ在形成纤维性沉积前的中间体状态，即Aβ寡聚体亦可产生神经毒性作用。动物实验研究表明，Aβ寡聚体可以在生理水平明显抑制大鼠海马的突触传递[5，6]，提示可溶性Aβ寡聚体可能是导致AD病人脑内突触功能障碍和突触丢失的主要效应物。

突触可塑性是学习和记忆的基础，在AD早期主要表现为显著的记忆损害，资料表明这一表现起始于海马突触功效的微弱改变，而此改变早于显著的神经元退行性变[2，3]，而突触丧失与AD患者的痴呆程度直接相关[7]。

神经颗粒素(Neurogra-nin， Ng)属Calpacitin蛋白家族，是一种神经元特异性蛋白。主要存在于大脑皮层、海马和嗅球，Ng 分布于成熟神经元的胞体、核周、树突和树突棘，但多数Ng仍积聚于树突的胞质内，可作为一种中枢神经系统病变树突受损的一种标记物[8，9]。Ng与学习、记忆相关的海马、神经递质及其受体、蛋白激酶等关系密切，在正常生理状态下，即细胞内Ca2+水平低时，Ng与CaM结合，而在细胞内高Ca2+浓度状态下，Ng与CaM分离，释放出游离的CaM，从而实现对CaM及Ca2+/CaM依赖性蛋白酶，如Ca2+/CaM-依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium-calmodulin-dependentkinaseⅡ，CaMKⅡ)及Ca2+/CaM-依赖性腺苷酸环化酶等活性的调节。Ng在突触的发育、突触的稳定性和可塑性中起重要作用[10]，因此，我们以Ng做为突触结构和功能可塑性的观察指标，摸索Aβ25-35寡聚体致突触损伤的浓度，亦可用做观察药物突触保护作用的指标。

实验中我们以5、10、20μmol/L浓度的Aβ25-35寡聚体加入原代培养7d的大鼠海马神经元培养基中，观察发现，10μmol/L Aβ25-35寡聚体组细胞数目减少，大部分神经元胞体缩小，突起数目减少，断裂或消失，并可见到少量细胞碎片，而20μmol/L寡聚体浓度组细胞突起消失，细胞胞膜已破裂，有很多细胞碎片，PBS冲洗后，碎片脱落，无法做免疫细胞化学染色。免疫细胞化学染色后采集图像，进行灰度定量分析，白色灰度值最高为255，黑色最低为0，灰度值越低，表明着色越多，Ng表达越强。结果，5μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng表达略有减少，但与正常组比较差异无显著性(P﹥0.05)；10μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng表达减少较明显；20μmol/L Aβ25-35寡聚体组Ng表达明显减少。试验再重复2次，结果相同。故认为Aβ25-35寡聚体引起的Ng减少具有剂量依赖性，致突触损伤模型的最佳有效浓度为10μmol/L。

本研究结果表明，Aβ25-35寡聚体能降低Ng的表达，呈剂量依赖性，10μmol/L Aβ的致伤作用非常显著。可以推测，在此浓度作用下突触后信号转导和整合出现障碍，突触可塑性严重受损，此数据可为AD早期突触损伤模型的建立提供实验依据。

随着对Aβ寡聚体致伤机制的深入了解，对AD复杂的病因及发病机制的不断探究，特别对于AD早期认知障碍与突触功能损害的进一步认识，将为AD的发病机制研究探索出新的途径，也为AD的早期干预、治疗以及新药物的研发开拓新的思路与方向。

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WEIRong-cui,FANGYing-hua,ZHAOXiu-qin,ZHANGDao-chun,HUANGXin-yan

(Institute of Neuroscience,Jiamusi University,Jiamusi 154002,China)

Objective:To investigate neurotoxicity in synapses of primary cultured hippocampal neurons induced by Aβ25-35 oligomers.Methods:The hippocampal neurons were incubated by Aβ oligomers with different concentration for 1 hour.Ng was used as index of the measure synaptic damage.The expression of PSD-95 was detected by using immunohistochemical SABC method.Result:Compared with the normal group,the expression of Ng decreased in 1μmol/L Aβ group，5μmol/L Aβ group (P<0.05,P<0.01).The latter is more significant (P<0.01) with statistical significance.Conclusion:Neurotoxicity in Synapse induced by Aβ25-35oligomers is associated with concentration in a dose-dependent manner.

β-Amyloid peptide fragment 25-35(Aβ25-35)；primary cultivation; Ng

佳木斯大学科研项目，编号：s2013-052。

作者介绍：尉荣翠(1969～)女，黑龙江佳木斯人，本科，副主任护师。

黄昕艳(1969～)女，黑龙江佳木斯人，硕士， 主任医师。E-mail:huangxiyan@163.com。

R329.2

A

1008-0104(2016)05-0050-03

2016-05-12)Neurotoxicity in synapse of primary cultured hippocampal neurons induced by Aβ25一35 oligomers