中药对大鼠肝纤维化MMP-13及α-SMA的影响①

卢凤美，林昔，刘东璞，徐霄航，孟庆媛，盛延良，姚海涛

(1.佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学药学院,黑龙江 佳木斯 154007)



中药对大鼠肝纤维化MMP-13及α-SMA的影响①

卢凤美1，林昔1，刘东璞1，徐霄航2，孟庆媛1，盛延良1，姚海涛1

(1.佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学药学院,黑龙江 佳木斯 154007)

目的:探讨中药红景天、大黄酸(Rhein 1,8-二羟基-3-羧基蒽醌)对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型肝组织中MMP-13及α-SMA的表达的影响。方法:本实验用四氯化碳诱导建立大鼠肝纤维化模型。健康♂SD大鼠70只，随机分组：(1)对照组(10只)；(2)模型组(20只)；(3)干预组1(大黄酸组，20只)；(4)干预组2(红景天组，20只)。于实验8周后处死大鼠取肝组织检测MMP-13mRNA、α-SMAmRNA及蛋白的表达情况。结果:红景天、大黄酸干预组肝组织中MMP-13mRNA及蛋白阳性表达均高于模型组(P<0.05)；红景天、大黄酸干预组肝组织中α-SMAmRNA及蛋白阳性表达均低于模型组(P<0.05)；肝组织MMP-13mRNA表达与α-SMAmRNA表达水平变化呈负相关。结论:中药红景天与大黄酸均能有效促进肝纤维化大鼠肝脏中MMP-13、抑制α-SMA表达；中药大黄酸和红景天都能保护肝细胞活性,促进肝细胞修复再生，具有抗肝纤维化作用。

红景天；大黄酸 ；MMP-13； α-SMA

近年来肝病已是威胁我国百姓健康的一大杀手。肝病中肝纤维化是肝硬化、肝癌等的必由之路，因此对肝纤维化的治疗和逆转是治疗肝病的重要环节。复方红景天对肝纤维化的治疗报道较多，同时对肝纤维化肝组织内相关成分表达情况的影响也有各案报道[1～2]，肝脏纤维化的病理生理学发生机制极其复杂,首先，肝细胞在各种损伤性因素作用下受损发生变性、坏死合并炎症反应,使肝窦内的枯否细胞活化释放大量的细胞因子,进而激活Diss腔内贮脂细胞,使之发生功能转变,转化为肌纤维母细胞,表达平滑肌肌动蛋白(α-SMA)导致细胞外基质增生沉积,降解减少,形成肝纤维化，其中基质金属蛋白酶(matrix metal proteases,MMPs)[3～7]是降解细胞外基质的主要酶类，金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metal protease,TIMPs)则通过抑制基质金属蛋白酶的活性抑制肝星状细胞凋亡及抑制细胞外基质降解的双重作用致肝纤维化。

本研究旨在观察中药红景天、大黄酸对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠肝脏胶原沉积的影响，用免疫组织化学和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术方法研究大鼠肝纤维化在红景天和大黄酸干预下对α-SMA及MMP-13表达的影响,分析不同组别间α-SMA及MMP-13 表达差异的意义,了解其对大鼠肝脏α-SMA及MMP-13基因表达的影响，对比二者抗肝纤维化作用的疗效。进一步从分子水平和蛋白水平探讨红景天和大黄酸干预实验性大鼠肝纤维化的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

体重185～240g的健康♂SD大鼠70只,由佳木斯大学实验动物中心提供。

1.2 实验药品

CCl4购于广州化学试剂三厂,红景天胶囊购自广东长兴科技尊然健康管理有限公司，大黄酸粉剂购自西安昊轩生物有限公司。RT-PCR试剂盒(大连宝生物生物工程有限公司),α-SMA及MMP-13免疫组化试剂盒(武汉博士德生物有限公司)。

1.3 方法设计

1.3.1 实验动物分组

健康♂SD大鼠70只，随机分组:(1)对照组(10只)生理盐水灌胃+橄榄油腹腔注射；(2)模型组(20只)用CCl4ip法诱导大鼠肝纤维化模型,即用100mL/L CCl4(橄榄油稀释)1mL/kg,1次/周,同时给予生理盐水灌胃2次/周，共8周；(3)干预组1(20只)在造模同时给予大黄酸灌胃(50μg/kg，2次/周，共8周)；(4)干预组2(20只)在造模的同时给予红景天灌胃(浓度40g/L,剂量10mL/kg,2次/周,共8周)。在造模的同时给予红景天灌胃(浓度40g/L,剂量10mL/kg,2次/周,共8周)。各组间暴露因素无差别(P>0.05)。各组大鼠在最后一次CCl4腹腔注射给药后48h处死,取新鲜肝组织迅速放到-80℃冰箱冻存，其余肝脏用福尔马林固定,留做病理检材。(试验中CCl4、红景天剂量均在前期试验中探索出最佳剂量)[8]。

1.3.2 检测方法

①常规石蜡切片肝纤维化造模检测。②免疫组织化学法检测肝组织MMP-13、α-SMA表达。按试剂盒说明书操作。③RT-PCR检测肝组织MMP-13、α-SMAmRNA:MMP-13 360bp S:5，-TATAGCAACAATTCTGGCG-3,；A:5,-CTGGTGGTGAAGAGCCAC-3,α-SMA 101Bp S:5，-AAGAGGAAGACAGCACAGCTC-3,；A:5,-GATGGATG-GGAAAACAGCC-3,按PCR试剂盒说明操作β-actin作为内参。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 经病理主任医师诊断80%(16/20)模型组大鼠肝纤维化为3期以上，20%(4/20)纤维化程度超过2期。干预组1(大黄酸)和干预组2(红景天)肝纤维化程度均较模型组轻。

2.2 MMP-13、α-SMA免疫组化:大鼠肝组织MMP-13、α-SMA表达：模型组大鼠较正常组肝组织MMP-13蛋白的水平显著降低(P<0.05)；干预组1与干预组2大鼠肝组织中MMP-13蛋白的水平较模型组显著增高(P<0.05，表1，图1)。干预组1与干预组2两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。肝组织中α-SMA蛋白表达的变化在正常组织切片中呈微弱水平表达,阳性信号主要见于窦周间隙中。模型组较对照组肝组织α-SMA蛋白的表达显著增强,以窦周间隙中胞浆阳性表达最明显，差异有统计学意义(P<0.05)。干预组1、干预组2比较模型组大鼠肝组织中α-SMA蛋白的水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)，见表1，图2。两中药干预组(干预组1与干预组2)间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A B C D

图1 肝组织中MMP-13表达 A 正常对照组 B 模型组 C 红景天干预组D大黄酸干预组

A B C D

表1 肝组织MMP-13、α-SMA表达的变化

注：aP<0.05vs模型组;a1P<0.05vs模型组;a2P<0.05vs模型组;P>0.05a1vsa2。

2.3 RT-PCR结果：模型组大鼠肝组织MMP-13mRNA的水平较正常组显著降低(P<0.05)；干预组1与干预组2大鼠肝组织中MMP-13mRNA的水平较模型组显著增高(P<0.05，表2) 干预组1与干预组2两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组较对照组大鼠肝组织α-SMAmRNA的水平显著增高(P<0.05)；干预组1、干预组2大鼠肝组织中α-SMAmRNA的水平较模型组低，其A值相比差异有统计学意义(P<0.05,表2)。干预组1与干预组2两组间比较差别不明显，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 肝组织MMP-13mRNA、α-SMAmRNA表达的变化

注：aP<0.05vs模型组;a1P<0.05vs模型组;a2P<0.05vs模型组;P>0.05a1vs a2。

3 讨论

由于各种损伤性因素的作用，肝脏细胞受到损伤时，活化了处于静止状态的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)，产生大量的细胞外基质(EMC Ⅰ、Ⅱ型胶原)，同时产生大量抑制纤维化因子如间质金属蛋白酶-2( matrix metalloproteinases-2，MMP-2)及促纤维化因子如金属蛋白酶组织抑制剂-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase1，TIMP-1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等，在肝纤维化时表现为细胞外基质合成增多，大量沉积,同时肝脏的原有结构被破坏[4]。MMP-13可以抑制肝纤维化的发生，降解EMC。肝星状细胞活化，MMP-13/α-SMA比值降低，细胞外基质(EMC)降解减少,肝组织内Ⅰ、Ⅱ型胶原沉积增多,进而加剧肝纤维化的发生发展。因此，MMP-13/α-SMA对肝纤维化的发生和发展起着重要的作用[9]。

通过多年的基础与临床研证实中药红景天具有从多层次多靶位抗肝纤维化作用的特点[10,11]。红景天对大鼠肝纤维化模型的治疗效果前期实验已经证实,同时二者之间存在一定的剂量关系，其治疗肝纤维化的机制可能是红景天能有效保护肝脏细胞，增加MMP-13蛋白及mRNA的表达,降低肝纤溶颗粒可明显降低大鼠肝脏α-SMA表达及mRNA的表达，上调MMP-13/α-SMA比值。本实验目的在于对比大黄酸与红景天在抗肝纤维化方面的作用。结果显示经大黄酸和红景天干预组，病理切片组织学观察大鼠肝细胞的变性、坏死以及炎症反应均较模型组减轻，门管区及中央静脉周围的纤维化程度明显减轻，免疫组化和RT-PCR检测结果均显示干预组MMP-13表达较模型组增高，α-SMA表达较模型组下降，证明大黄酸和红景天同样具有较好的抗纤维化作用，大黄酸具有良好的抗氧化和抗炎的作用，因而可有效保护肝细胞，减轻肝脏损伤，抑制肝脏星状细胞活化，上调MMP-13/α-SMA比值从而增加胶原降解，减少细胞外基质分泌，有效抑制肝纤维化的发生发展。

[1]刘东璞,卢凤美，孟庆媛，等.红景天对大鼠肝纤维化肝脏中TIMP-1、Smad4表达的影响[J].中国老年学杂志，2012，,32(12)：2556-2558

[2]卢凤美,刘东璞，郭梦凡.红景天对大鼠肝纤维化肝脏中Smad4、Smad7表达的影响[J].中国老年学杂志，2013,33(6)：1314-1316

[3]Carpino G,Morini S,Ginanni Corradini S,et al.Alpha-SMA expression inhepatic-stellate cells and quantitative analysis of hepatic fibrosis in cirrhosis and in recurrent chronic hepatitis after liver transplantation[J].Dig Liver Dis，2005，37:349-356

[4]E Huet,B Vallee,D Szul,et al.Gabison.Extracellular matrix metalloproteinase inducer/CD147 promotes myofibroblast differentiation by inducing alpha-smooth muscle actin expression and collagen gel contraction:implications in tissue remodeling[J].FASEB J,2008，22:1144-1154

[5]Kato N,Kosugi T,Sato W,et al.Basigin/CD147 Promotes Renal Fibrosis after Unilateral Ureteral Obstruction[J].The American Journal of Pathology，2011，178(2):572-579

[6]K Philipp,F Riedel,G Germann,et al.Sauerbier TGF-beta antisenseoligonucleotides reduce mRNA expression of matrix metalloproteinases in cultured wound-healing-related cells[J].Int J Mol Med,2005，15:299-303

[7]MA Karsdal,L Larsen,MT Engsig,et al.Foged Matrix metallo proteinase-dependent activation of latent transforming growth factor-beta controls the conversion of osteoblasts into osteocytes by blocking osteoblast apoptosis[J].J Biol Chem,2002，277:44061-44067

[8]刘东璞，卢凤美,张辉，等.CCl4诱导大鼠肝纤维化模型的建立[J].黑龙江医药科学2009,32(4):14-15

[9]武超，曹红燕，孙明瑜.大黄酸在肝病中的应用研究[J].辽宁中医杂志，2015,42(12):2382-2387

[10]刘东璞,卢凤美,孟庆媛,等.红景天对 AFB1致大鼠肝癌中Survin表达的影响[J].黑龙江医药科学，2013,36(5):91-92

[11]刘翠杰,宋汉君.红景天苷对肝癌细胞凋亡的诱导实验研究[J].黑龙江医药科学，2013,36(4):90-91

1.佳木斯大学面上项目，编号:S2013-036;2.佳木斯大学面上项目，编号:S2014-001。

卢凤美(1970～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，副教授。

刘东璞(1969～)男，黑龙江佳木斯人，副教授，硕士研究生导师。E-mail:liudongpu1220@163.com。

R285.5；R575.2

A

1008-0104(2016)05-0046-02

2016-05-18)