内热针联合臭氧穴位注射介入治疗家兔膝骨关节炎的实验研究*

李 敏 袁桂平

（湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000）

·证治探讨·

内热针联合臭氧穴位注射介入治疗家兔膝骨关节炎的实验研究*

李 敏 袁桂平△

（湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000）

目的 观察内热针联合臭氧注射“内外膝眼、梁丘”介入治疗对家兔膝骨关节炎（KOA）的影响。方法32只家兔随机分为模型组、内热针组、臭氧组和内热针+臭氧组4组，每组8只。采用弗氏完全佐剂注射家兔前右肢膝关节腔制备KOA模型；成模后内热针组取“内外膝眼、梁丘、阳陵泉、鹤顶、足三里、血海”等诸穴内热针治疗，臭氧组膝取 “内外膝眼、梁丘”小剂量注射臭氧；内热针+臭氧组为内热针组和臭氧组的治疗方法；用表面肌电图仪录股内侧肌（vM）和股外侧肌（vL）肌电信号并计算vM/vL达峰值时限差值（ΔTBP），记录家兔坐骨神经阈刺激、最大刺激和传导速度；检测家兔关节积液中透明质酸（HA）、白细胞介素-1β（IL-1β）及基质金属蛋白酶（MMPs）表达。结果 治疗后模型组家兔坐骨神经阈刺激、最大刺激阈值和传导速度与治疗前比较未见升高（P＞0.05）。内热针组、臭氧组和内热针+臭氧组阈刺激与治疗前比较均升高（均P＜0.05）。内热针组阈刺激和臭氧组比较差别不大（P＞0.05）。内热针+臭氧组阈刺激与同组治疗前比较升高（P＜0.05），且与模型组、内热针组和臭氧组比较升高明显（均P＜0.05）。4组坐骨神经传导速度和最大刺激阈值与治疗前比较差别不大，且治疗后各组比较差别不大（均P＞0.05）。模型组vM、vL和ΔTBP与治疗前比较无明显变化（均P＞0.05）。内热针组、臭氧组和内热针+臭氧组vM、vL与治疗前比较均升高，而ΔTBP降低（均P＜0.05）。内热针组M、vL和ΔTBP与臭氧组比较差别不大 （均P＞0.05）。内热针+臭氧组vM、vL与治疗前比较升高，而ΔTBP降低（均P＜0.05），且优于模型组、内热针组和臭氧组（均P＜0.05）。模型组IL-1β和HA与治疗前比较无明显变化（P＞0.05）。内热针组、臭氧组和内热针+臭氧组与治疗前比较，IL-1β含量均下降，HA含量均增加（均P＜0.05）。臭氧组IL-1β降低和HA升高幅度均大于内热针组（P＜0.05）。内热针+臭氧组IL-1β和HA与同组治疗前比较IL-1β含量下降，HA含量增加（P＜0.05），且优于模型组、内热针组和臭氧组（P＜0.05）。模型组和内热针组家兔血清MMPs与同组治疗前比较无明显变化（均P＞0.05）。臭氧组MMP-2和MMP-10与治疗前比较低表达（P＜0.05），且优于模型组（P＜0.05）。内热针+臭氧组MMP-2和MMP-10与治疗前比较均降低（P＜0.05），且优于模型组和内热针组（均P＜0.05），但与臭氧组、模型组比较差别不大（P＞0.05）。结论内热针刺激可祛寒除湿、降低IL-1β造成的局部炎症反应，并纠正患肢肌电以降低痛阈，臭氧穴位注射介入治疗可抑制MMPs对关节组织细胞外基质降解、提高HA分泌，两者具有明显协同治疗作用。

KOA模型 家兔 内热针 臭氧 ΔTBP 肌电信号

膝骨性关节炎（KOA）是导致生活质量下降的常见病和多发病，属中医学“筋痹”“骨痹”范畴［1］。KOA按病因可分为原发性和继发性，原发性KOA的病因可能与机械性和生物性等因素的相互作用造成关节软骨细胞、基质和软骨合成和降解失衡，骨赘形成有关。继发性KOA则多与关节外伤、代谢病、类风湿病等内分泌失衡等有关［2］。两类KOA多随膝骨关节面滑膜毛细血管扩张和通透性增大，最终因关节腔内组织液大量渗出而形成关节积液［3］。本研究采取内热针配合臭氧注射穴位介入治疗家兔KOA，研究治疗KOA的镇痛消炎的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 家兔32只，体质量1.8～2.2 kg，雌雄各半，由十堰太和医院实验中心提供［SCXK（鄂）2014-0008］。

1.2 仪器与试剂 表面肌电图仪 （美国Noraxon生产）；BL-420生物信号记录系统（成都泰盟生产）。臭氧（太和医院制剂室提供）；弗氏完全佐剂（上海实生细胞生物技术有限公司提供）；MMPs测试盒 （上海森雄科技实业有限公司提供）。

1.3 造模 将弗氏完全佐剂1周内分3次注人家兔右膝关节腔，每次注射0.1 mL。注射后根据超疲劳可导致KOA发病的临床特点，每日强迫动物活动60 min［4］。成模标准:2周后家兔出现右膝局部软组织红肿、关节僵硬跛行，关节腔可抽出积液，且积液检查出现HA降低和IL-1β明显高于正常值［5］。出现以上体症即可确定KOA造模成功。

1.4 治疗方法 家兔随机均分为模型组、内热针组、臭氧组和内热针+臭氧组4组，每组8只。模型组动物每日仅做消毒处理。内热针组，将家兔固定于家兔固定器，取“内外膝眼、梁丘、阳陵泉、鹤顶、足三里、血海”等诸穴由内向外斜刺2 cm，刺入骨膜后，接NRZ-16R-E型内热针治疗仪，参数:针体温度40～60℃，留针加热28 min，每日1次，14 d为1个疗程。臭氧组于“内外膝眼、梁丘”各注射臭氧0.1 mL，每隔日1次，注射7次为1个疗程。内热针+臭氧组治疗方法同内热针组和臭氧组，疗程同前。

1.5 观察指标 从家兔耳缘静脉取血，采用PCR法测定治疗前后MMP-2、MMP-10表达［5］；治抽取各组动物关节腔积液，HA采用放免试剂盒检测，IL-1β采用ELISA法检测［6］。用表面肌电图仪录股内侧肌（vM）和股外侧肌（vL）肌电信号并计算vM/vL达峰值时限差值（ΔTBP）［7］。BL-420生物信号记录系统记录治疗前后记录家兔坐骨神经阈刺激、最大刺激阈值和传导速度。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析对和组指标进行比较，组间差异采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组治疗前后家兔坐骨神经阈刺激、最大刺激阈值和传导速度比较 见表1。治疗后模型组家兔坐骨神经阈刺激、最大刺激阈值和传导速度与治疗前比较未见升高（P＞0.05）。内热针组、臭氧组和内热针+臭氧组阈刺激与治疗前比较均升高（均P＜0.05）。内热针组阈刺激和臭氧组比较差别不大（P＞0.05）。内热针+臭氧组阈刺激与同组治疗前比较升高（P＜0.05），且与模型组、内热针组和臭氧组比较升高明显（均P＜0.05）。各组坐骨神经传导速度和最大刺激阈值与治疗前比较差别不大，且治疗后各组比较差别不大（均P＞0.05）。

表1 各组家兔治疗前后阈刺激、最大刺激阈值和传导速度比较（±s）

表1 各组家兔治疗前后阈刺激、最大刺激阈值和传导速度比较（±s）

与本组治疗前比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与内热针组比较，#P＜0.05；与臭氧组比较，▲P＜0.05。下同。

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2.2 各组家兔治疗前后vM、vL肌电信号及ΔTBP比较 见表2。治疗后，模型组vM、vL和ΔTBP与治疗前比较无明显变化（均P＞0.05）。内热针组、臭氧组和内热针+臭氧组vM、vL与治疗前比较均升高，而ΔTBP降低（均P＜0.05）。内热针组M、vL和ΔTBP与臭氧组比较差别不大（均P＞0.05）。内热针+臭氧组vM、vL与治疗前比较升高，而ΔTBP降低（均P＜0.05），且优于模型组、内热针组和臭氧组（均P＜0.05）。

表2 各组家兔治疗前后vM、vL和ΔTBP比较（±s）

表2 各组家兔治疗前后vM、vL和ΔTBP比较（±s）

组别 时间 ΔTBP模型组 治疗前 7.71±0.25（n＝8） 治疗后 6.79±0.12内热针组 治疗前 7.35±0.26 vM（μV） vL（μV）215.15±21.78 152.93±7.66 210.35±23.12 147.58±9.21 213.74±25.07 150.41±9.62（n＝8） 治疗后 3.71±0.24*△286.31±31.70*△175.23±11.01*△臭氧组 治疗前 210.93±23.53 151.44±7.97 7.29±0.23（n＝8） 治疗后 279.45±27.19*△177.50±12.21*△3.08±0.12*△内热针+臭氧组 治疗前 215.27±26.40 153.02±8.75 7.60±0.25（n＝8） 治疗后 312.71±35.68*△#▲191.76±21.52*△#▲1.96±0.10*△#▲

2.3 各组家兔治疗前后HA和IL-1β水平比较 见表3。治疗后，模型组IL-1β和HA与治疗前比较无明显变化（P＞0.05）。内热针组、臭氧组和内热针+臭氧组与治疗前比较，IL-1β含量均下降，HA含量均增加（均P＜0.05）。臭氧组IL-1β降低和HA升高幅度均大于内热针组（P＜0.05）。内热针+臭氧组IL-1β和HA与同组治疗前比较IL-1β含量下降，HA含量增加 （P＜0.05），且优于模型组、内热针组和臭氧组（P＜0.05）。

表3 各组家兔治疗前后IL-1β和HA水平比较（±s）

表3 各组家兔治疗前后IL-1β和HA水平比较（±s）

IL-1β（pg/mL） HA（μg/L）72.33±9.24 4.71±0.27 79.51±10.12 4.01±0.25 70.45±7.46 4.79±0.24（n＝8） 治疗后 54.04±7.13*△6.72±0.35*△臭氧组 治疗前 71.72±7.52 4.53±0.29（n＝8） 治疗后 41.52±6.73*△#8.03±0.40*△#内热针+臭氧组 治疗前 70.58±8.73 4.64±0.22（n＝8） 治疗后 32.43±5.28*△#▲10.73±0.57*△#▲组别 时间模型组 治疗前（n＝8） 治疗后内热针组 治疗前

2.4 各组家兔血清基质金属蛋白酶水平比较 见表4。模型组和内热针组家兔血清MMPs与同组治疗前比较无明显变化（均P＞0.05）。臭氧组MMP-2和MMP-10与治疗前比较低表达（P＜0.05），且优于模型组（P＜0.05）。内热针+臭氧组MMP-2和MMP-10与治疗前比较均降低（P＜0.05），且优于模型组和内热针组（均P＜0.05），但与臭氧组模型组比较差别不大（P＞0.05）。

表4 各组家兔血清基质金属蛋白酶比较（ng/L，±s）

表4 各组家兔血清基质金属蛋白酶比较（ng/L，±s）

MMP-1 MMP-2 90.21±7.72 85.26±9.14 92.12±8.32 87.21±9.27 89.72±8.13 86.27±7.02（n＝8） 治疗后 90.23±7.24 88.93±9.35臭氧组 治疗前 91.71±9.22 86.03±7.65（n＝8） 治疗后 90.80±6.81 70.25±7.96*△内热针+臭氧组 治疗前 90.22±8.53 85.55±7.81（n＝8） 治疗后 89.87±9.85 67.29±7.92*△#组别 时间模型组 治疗前（n＝8） 治疗后内热针组 治疗前MMP-9 MMP-10 70.22±7.24 75.02±5.93 73.72±7.21 78.38±8.04 73.17±6.99 73.95±8.30 71.70±7.65 69.26±6.14 72.19±7.11 75.48±8.04 69.05±8.25 55.70±5.32*△71.22±6.53 73.59±6.90 68.37±9.02 51.12±6.27*△#

3 讨 论

KOA病理改变以IL-1β对关节腔和滑膜的炎性浸润并伴随软骨细胞外MMPs的病理性降解为主，常造成关节面软骨破坏和关节腔内组织液大量渗出而成关节腔积液［8］。中医学认为，KOA是膝关节局部血瘀气滞，湿浊之气痹阻于膝而致，故治宜“除痹利湿、舒筋通络、行气止痛、活血化瘀”［9］。

IL-1β在正常关节腔积液仅有少量分秘，当有KOA病理改变时，IL-1β会异常分秘。而HA可抑制KOA关节内IL-1β等造成的炎症反应，润滑关节并降低滑膜的通透性，从而减少关节内渗液造成的成关节腔积液［10］。本实验内热针+臭氧组在对“内外膝眼、梁丘、阳陵泉、鹤顶、足三里、血海”等诸穴进行内热针后，利用内热针对热的传导，将热量导入病变组织深部来改善组织局部微循环、促进炎性因子的吸收，加速组织修复，故IL-1β降低［11］。而且内热针可降低骨骼肌张力，使紧张的肌肉松弛，同时还可提高阈刺激，提高对疼痛刺激的敏感性［12］。内热针+臭氧组在“内外膝眼、梁丘”注射臭氧后，臭氧作为强氧化剂，可直接作用于关节邻近韧带和周围组织分布的神经末梢，臭氧的强氧化作用造成IL-1β等致痛炎性因子失活，减少对神经末梢的刺激，起到“化学针灸”的止痛效果。还可通过拮抗炎症反应中的免疫因子释放扩张血管、改善静脉回流、减轻神经根水肿及粘连达到抗炎作用［13］。由于IL-1β等致痛炎性因子失活，机体致痛炎性因子减少，故监测到的vM、vL等肌电话活动均升高，ΔTBP降低。研究表明，基质降解的主要蛋白是MMP-2和MMP-10，其增高表达与KOA发生密切相关［14］。在通过臭氧穴位注射后，笔者观察到内热针+臭氧组关节积液中MMP-2和MMP-10的表达明显降低，说明臭氧的强氧化作用在一定程度可以抑制MMP-2和MMP-10分泌。MMP-2和MMP-10减少可减轻其对关节组织细胞外基质的降解［15］，不可促使滑膜内衬B型滑膜细胞分泌HA，而HA可起到润滑关节和保护关节作用［16］。总之，通过内热针和臭氧治疗后，内热针+臭氧组vM、vL和阈刺激明显提高，ΔTBP降低，关节液中IL-1β明显降低、HA明显提高，关节积液中MMP-2和MMP-10的表达明显降低。

综上，内热针治疗可改善组织局部微循环、促进炎性因子的吸收，提高机体对疼痛刺激的敏感性。臭氧的强氧化作用可起到抗炎止痛、抑制MMP-2和MMP-10分泌，提高HA分泌的作用。两者相辅相成，可明显提高治疗效果，这对于临床治疗KOA有一定的指导意义。

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Experimental Study on the Treatment of Rabbit Knee Osteoarthritis with Acupoint Injection of Ozoneand Heat-type Acupuncture Needles

LI Min，YUAN Guiping.Department of Pain Management，Taihe Hospital，Hubei，Shiyan 442000，China.

Objective:To observe the curative effect of the heat-type acupuncture needles combined with ozone injection on Inner and Outer Xiyan acupoints and Liangqiu acupoint in treating the rabbit knee osteoarthritis（KOA）.Methods:32 rabbits were randomly divided into model group，acupuncture group and ozone group and acupuncture plus ozone group，8 rabbits in each group.Freund′s complete adjuvant was injected into the front right limb knee joint cavity of the rabbits to establish KOA models.In the acupuncture group，we used the heattype acupuncture needles on the following acupoints:Inner and Outer Xiyan，Liangqiu，Yanglingquan，Heding，Zusanli，Xuehai，etc.In the ozone group，we injected small dose of ozone on Inner and Outer Xiyan acupoints and Liangqiu acupoint.In the acupuncture plus ozone group，we used the two therapies together.We recorded theEMG signals of the vastus medialis（vM）and the vastus lateralis（vL）using the surface electromyography（sEMG）system and calculated the vM/vL peak time difference（ΔTBP）.Moreover，we recorded the rabbit sciatic nerve threshold stimulation，maximum threshold of sciatic nerve stimulation and sciatic nerve conduction velocity，detected the hyaluronic acid of rabbit articular effusion（hyaluronic acid HA），interleukin-1 beta（interleukin-1 beta，beta IL-1）and joint cartilage expression of matrix metalloproteinases（matrixmetalloproteinases，MMPs）.Results:After the treatment，the rabbit sciatic nerve threshold stimulation，maximum threshold of sciatic nerve stimulation and sciatic nerve conduction velocity in the model group did not increase（P＞0.05）.The sciatic nerve threshold stimulation in the acupuncture group，ozone group and acupuncture plus ozone group increased after the treatment（all P＜0.05）.There was little difference on the sciatic nerve threshold stimulation between the acupuncture group and the ozone group（P＞0.05）.The sciatic nerve threshold stimulation in the acupuncture plus ozone group increased after the treatment compared with the same group before the treatment（P＜0.05）and increased significantly than that of the model group，the acupuncture group and the ozone group（all P＜0.05）.The maximum threshold of sciatic nerve stimulation in all the groups did not change a lot after the treatment and there was little difference on the value among the four groups（all P＞0.05）.The vM，vL and ΔTBP in the model group did not change a lot after the treatment（all P＞0.05）.The vM and vL increased but ΔTBP decreased（all P＜0.05）in the acupuncture group，ozone group and acupuncture plus ozone group after the treatment.There was little difference on the vM，vL and ΔTBP between the acupuncture group and the ozone group（all P＞0.05）.The vM and vL increased but ΔTBP decreased（all P＜0.05）in the acupuncture plus ozone group after the treatment whose result was better than that of the model group，the acupuncture group and the ozone group（all P＜0.05）. The content of IL-1β and HA in synovial fluid in the model group did not change much after the treatment（P＞0.05）.The content of IL-1β in synovial fluid decreased and the content of HA increased（all P＜0.05）in the acupuncture group，ozone group and acupuncture plus ozone group after the treatment.The decreased extent of IL-1β and increased extent of HA in the ozone group was higher than that of the acupuncture group（P＜0.05）. The content of IL-1β in synovial fluid decreased and the content of HA increased（P＜0.05）in the acupuncture plus ozone group after the treatment whose result was better than that of the model group，the acupuncture group and the ozone group（P＜0.05）.The expression of MMPs in the model group and the acupuncture group did not change much after the treatment（all P＞0.05）.The expression of MMP-2 and MMP-10 in the ozone group was lower after the treatment（P＜0.05）and was better than that of the model group（P＜0.05）.The expression of MMP-2 and MMP-10 in the acupuncture plus ozone group was lower after the treatment（P＜0.05）whose result was better than that of the model group and the acupuncture group（all P＜0.05），but was almost the same with that of the ozone group（P＞0.05）.Conclusion:The heat-type acupuncture needles stimulation helps with dispelling coldness and dehumidification，reducing local inflammation response caused by IL-1β，correcting limb EMG to reduce the pain threshold.The ozone acupoint injection treatment can inhibit the expression of MMPs to help with the degradation of joint tissue extracellular matrix and improving the secretion of HA.These two ways have obvious synergistic effects.

KOA model；Rabbit；Heat-type acupuncture needles；Ozone；ΔTBP；EMG signal

R246

A

1004-745X（2016）10-1866-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.010

湖北省科技厅项目（2013cfc037）

△（电子邮箱：limingllmmmm@163.com）

（2016-06-24）