Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia 杂种回交后代中筛选抗黑胫病异源染色体植株初报

党江波，梁国鲁，郭启高，向素琼，孙海艳，何桥，杨超，陈益银

1 西南大学，园艺园林学院，重庆市北碚区天生路2号 400716；2 中国烟草总公司重庆市公司，烟草研究所，重庆市北碚区天生路2号 400716

Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia杂种回交后代中筛选抗黑胫病异源染色体植株初报

党江波1，梁国鲁1，郭启高1，向素琼1，孙海艳1，何桥1，杨超2，陈益银2

1 西南大学，园艺园林学院，重庆市北碚区天生路2号 400716；2 中国烟草总公司重庆市公司，烟草研究所，重庆市北碚区天生路2号 400716

为从Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia杂种（2n=58）回交N. tabacum的后代中筛选对黑胫病具有较强抗性的植株，利用离体叶片侵染法对存活的120株后代植株进行了初步筛选。筛选分为两次，第1次为初选，对第1次接种后不发病和发病较轻的植株第2次接种进行复选，对经第2次接种后叶片不发病和发病较轻的植株进行基因组原位杂交（GISH）分析。结果显示：第1次接种后5株植株的叶片不发病和8株植株的叶片发病较轻；第2次接种后4株植株的叶片不发病，1株植株的叶片发病较轻。GISH鉴定结果显示：第2次接种后4株叶片不发病的植株携带1-4条N. plumbaginifolia染色体，叶片发病较轻植株则未见N. plumbaginifolia染色体，携带1条外源染色体植株的染色体数目为48。对这5株材料的离体叶片接种病原菌以对其离体叶片的黑胫病抗性进行再次鉴定，结果与复选时所得结果相近。综上所述，自Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia杂种回交一代（BC1）中筛选获得了4株叶片对黑胫病具有较强抗性的异源染色体植株，其中一株可能为异源单体代换植株。

普通烟草；N. plumbaginifolia；离体叶片；黑胫病抗性；异源单体代换系

远缘杂交作为作物品种改良的重要途径之一，在作物育种中占有极为重要的地位[1]。远缘杂交的一般程序可以归结为：杂交获得双单倍体、双单倍体经染色体加倍获得双二倍体，双二倍体回交获得倍半二倍体、倍半二倍体回交获得异源单体附加/代换系、异源单体附加/代换系经诱导获得异源易位系、杂交或回交获得稳定遗传的异源易位系[1]。其中异源染色体植株是远缘杂交过程中极为重要的中间材料，在远缘杂交中常以构建异源单体附加/代换系等为远缘杂交取得重要进展的标志。目前在众多作物的远缘杂交育种中获得了异源单体植株，其中对小麦[2]、水稻[3]、棉花[4]、油菜[5]等的报道较多。烟草远缘杂交虽然开展较早，也取得了较多成就，但是一般多以性状为追踪进行新材料的选育，而细胞遗传学研究则较少。因此在烟草中较少有异源单体附加材料的报道，在烟草属植物中也较少见报道[6-7]。

黑胫病是烤烟生产中具有毁灭性的重大病害之一，历年来给烟叶生产带来巨大损失[8]。烟草属中众多野生种对黑胫病具有较强的抗性，其中N.plumbaginifolia为较早应用于烟草抗黑胫病的种质之一[9-11]。虽然利用N. plumbaginifolia育成了一些抗黑胫病材料，但在我国烟草生产中未见大规模应用。此外，对N. plumbaginifolia及其衍生材料的相关研究有限，其众多特性鲜见介绍[12-13]。尤其是对抗黑胫病育种有重要意义的异源单体附加/代换系类材料报道更少[14]。

研究小组在利用N. plumbaginifolia进行烤烟抗黑胫病育种研究的实践中，首先通过云烟87八倍体（2n=8x=96） 与N. plumbaginifolia（2n=2x=20） 杂交获得了种间杂种（2n=58），并已证实其基因组中携带10条来自N. plumbaginifolia的染色体，经离体接种病原菌，该杂种叶片及茎段对黑胫病均有较强抗性，与N. plumbaginifolia相近。该杂种与云烟87四倍体回交获得了大量后代。经对离体叶片接种黑胫病病原菌，于这些回交后代中筛选获得少量叶片未见发病的材料，并对这些叶片不发病及发病较轻的材料进行了离体叶片抗病能力的第2次检测及基因组原位杂交分析，证实叶片未见发病的植株基因组中均携带来自N. plumbaginifolia的染色体。为后续对这些材料的进一步鉴定及应用提供重要数据，也期供烟草抗病远缘杂交育种提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

植物材料为云烟87八倍体与N. plumbaginifolia间的杂种（2n=58）与云烟87四倍体（2n=4x=48）回交所得。

病原菌：烟草黑胫病病原菌寄生疫霉烟草致病型（Phytophthora parasiticavarnicotianae）由西南大学资源环境学院李振轮教授赠送，分离自重庆市奉节县。

1.2 方法

1.2.1 植物材料准备

获得的回交种子播种于细土中，保湿，萌发生长至3～5叶时，移栽至7 cm×9 cm的营养钵中，共计移栽200株，待长至7叶期时开始取叶片离体接种病原菌液。

1.2.2 病原菌培养及接种液制备

烟草疫霉菌采用燕麦培养基培养。孢子诱导采用KNO3溶液诱导的方法[15]，将培养2 周以上的菌丝挑入0.1%的KNO3溶液中（每个直径为9 cm的培养皿中的菌丝转入20 mL KNO3溶液中），培养3 d后，经4℃处理40 min后取出，组织破碎仪打断菌丝，25℃放置20 min后加入1%葡萄糖接种。

1.2.3 离体叶片接种病原菌

接种分为3次，第1次接种为初选：选取7叶期植株叶片进行接种。由于此时期叶片较少，为减少对植株损伤，每株选取1片叶片进行。接种方法参考周嘉平等的[16]方法并作适当修改：取新鲜叶片，置于铺有湿润吸水纸的方形搪瓷盘中，用无菌针头于叶片主脉一侧刺穿以戳伤叶片，穿刺的位置为叶脉至叶沿中央处，每张叶片均于右侧选取两处，每处按0.5 cm见方穿刺4个点。接种量为菌液10 μL。接种完待液体稍干燥后用封口膜密封保湿，置于30℃黑暗处。分别于接种后4 ～10 d观察。

第2次接种为复选：是对第1次接种后未见发病或发病较轻的植株进行复选，在盛花期选取上部叶片进行，由于此时期叶片较多，故每株选取3片叶片进行，接种方法与初选时相同，但每张叶片只选取一处进行戳伤处理。

第3次接种为叶片抗病性确认：即复选后未见发病和发病较轻的植株，经染色体鉴定后再取叶片进行接种，接种方法与第2次相同。

每次接种均以云烟87四倍体和N. plumbaginifolia同时期相同叶位的叶片作为对照。

1.2.4 植株的GISH鉴定

取经第2次接种后不发病及发病较轻的植株进行GISH分析。有丝分裂中期染色体标本制作参照陈瑞阳等[17]的方法利用幼嫩子房进行。GISH参照Brammer 等[18]的方法并加以改进，以N.plumbaginifolia基因组DNA为探针，采用DIG-High Prime（罗氏）进行标记，探针终浓度为2.5 ng·μL-1；以云烟87基因组DNA为封阻，封阻浓度为探针浓度的10倍。以Anti-Digoxigenin- fl uorescein （罗氏）对探针进行染色，DAPI衬染，荧光显微镜（Olympus，日本）进行检测、拍照，随机软件cellSens Standard 1.9 （Olympus,日本）对照片进行处理。信号颜色模拟为红色，背景颜色为蓝色。

2 结果与分析

2.1 植株的筛选

种植N. tabacum-N. plumbaginifolia杂种回交后代200株，其中存活120株，对这120株存活植株7叶期的离体叶片进行第1次接种病原菌试验（初选）。结果表明，观察时间内（10 d）5株植株叶片没有发现病斑，8株叶片病斑较小，即其病斑面积未达到云烟87叶片的一半。N. plumbaginifolia叶片未见病斑出现。

第2次接种试验中，以第1次接种后不发病和发病较轻的植株共计13株的叶片为试验材料。结果显示，在观察时间内（10 d），该13株材料中仍有4株没有病斑，一株仅1片叶有病斑，其余植株均为2片以上叶有病斑。云烟87的3片叶片均呈现病斑，其中两张叶片病斑较大，一张叶片病斑较小。而N.plumbaginifolia叶片仍未见病斑出现。将4株叶片无病斑的回交后代分别编号为：YPBC1-1、YPBC1-2、YPBC1-3、YPBC1-4，有1片叶片发病的植株编号为YPBC1-5。

图1 部分回交后代第1次离体叶片人工侵染后的发病情况（4 d）Fig.1 Leaf performance of some BC1 plants 4 days after infection in the fi rst screening

2.2 部分植株的细胞学分析

以N. plumbaginifolia基因组DNA为探针，云烟87基因组DNA为封阻对上述经第2次接种（复选）后获得的4株叶片未见发病的植株和1株一片叶片发病的植株进行了基因组原位杂交（GISH）分析。结果显示，5株植株中，叶片不发病的4株植株均携带有来源于N. plumbaginifolia的染色体，叶片发病较轻的植株则未见来源于N. plumbaginifolia的染色体。4株携带有N. plumbaginifolia染色体的植株中有两株携带有两条外源染色体，这两株植株分别为YPBC1-1和YPBC1-2，YPBC1-3仅携带一条外源染色体（见图2 B），YPBC1-4携带有4条外源染色体。经染色体计数，YPBC1-1和YPBC1-2染色体数目为52条，YPBC1-3的染色体数目为48条（图2），YPBC1-4染色体数目为54。YPBC1-5未携带外源染色体，其染色体数目为53。

图2 携带1条N. plumbaginifolia染色体的植株（YPBC1-3）的离体叶片接种病原菌后的表现（4 d）及其染色体组成的GISH鉴定（2n=48）Fig.2 Leaf performance of a BC1 plant (YPBC1-3), which had one N. plumbaginifolia chromosome, 4 days after infection and alien chromosome identi fi cation according to GISH

取该5株材料再次进行接种试验，试验结果与上述二次试验结果相近，不同点在于此次试验YPBC1-5发病叶片为2片，其中一片发病较早，另一叶片发病较晚。10 d后发病较晚的叶片的病斑面积不及发病较早的叶片的病斑面积的一半。

可见，上述4株叶片不发病植株中携带N.plumbaginifolia抗病基因所在染色体，且其中一株（YPBC1-3）仅携带一条来源于N. plumbaginifolia染色体，该染色体中所携带的基因可能是使该植株离体叶片经黑胫病病原菌侵染而不发病的原因。

3 讨论

离体叶片侵染法在多种植物病害的研究及植物对病害的抗性鉴定中有所应用[19-21]。烟草黑胫病为土传病害，虽未见以离体叶片侵染法对烟草的黑胫病抗性进行鉴定的报道，但黑胫病病原菌对烟草叶片同样会产生危害，形成病斑[22]。在部分对烟草黑胫病的研究及烟草抗黑胫病新材料的初步筛选中对这种方法有所应用[16,23-24]。可见，这种方法虽不能对植株的黑胫病抗性进行鉴定，但可在一定程度上反映其抗性。本次筛选采用这种方法，目的主要是对回交后代进行初步筛选，以为后续进一步研究提供材料。后续可通过组织培养建立无性系，以其它方法对筛选获得植株的黑胫病抗性进行系统鉴定。

多次离体叶片接种试验均表明携带N.plumbaginifolia染色体的4株材料的叶片没有出现病斑，可见该4株材料的叶片确对黑胫病具有较强抗性，其抗性至少强于云烟87，与N. plumbaginifolia相近，这表明该4株材料可能对黑胫病具有较强的抗性。尤其其中1株仅携带1条N. plumbaginifolia染色体，其染色体数目为48条（图2 B），可能为异源单体代换系。后续需通过更多材料用以制片进行观察，并经减数分裂期核型结合GISH方可予以确认[25-26]。其余携带有N. plumbaginifolia染色体的植株由于与前述携带1条染色体的植株一样，均为杂种回交后代而非自交后代。所以，这些植株中的N. plumbaginifolia染色体必以单体存在，并无成对染色体存在的可能。因此，这些材料也具有一定的价值，可通过回交或自交在其后代中较大概率筛选到仅携带1条外源染色体的植株或携带1对外源染色体的植株。

此外，由于携带有外源染色体且叶片接种病原菌不发病的后代植株数量有限，对其形态、育性、烟叶性状以及其植株整体对黑胫病的抗性等特征仍不清楚，后续也需对该植株进行无性繁殖，积累更多材料以便对其进行更深入分析。

异源单体类植株在作物育种以及基因定位等基础研究方面有重大意义。部分表现优良的异源单体类植株可培育稳定遗传的异源二体植株以培育新品种[27]；利用异源单体类植株获取携带有目的基因的异源易位系较自携带多条外源染色体的材料中获取到的可能性更大，这使得异源单体类植株在远缘杂交育种中有重大的意义。本文所报道的1株携带1条N.plumbaginifolia染色体的植株，其叶片在离体条件下接种黑胫病病原菌无发病症状，这使得在普通烟草与N. plumbaginifolia的杂种后代中筛选抗黑胫病异源单体附加/代换系有一定的可能。同时也表明，利用N.plumbaginifolia进行烟草黑胫病抗性改良具备了一定的基础。此外，利用该异源单体植株可对该外源单染色体上的若干外源基因进行物理定位和连锁分析[28]，这将有助于对N. plumbaginifolia的进一步研究并对其加以更多利用。

由于该异源单体植株为种间杂种回交1代中选出，这表明在回交一代中筛选异源单体类植株是可能的。后续如利用N. plumbaginifolia进行烟草其它性状的改良，本文的方法可以提供一定的参考。

4 结论

自N. tabacum-N. plumbaginifolia杂种回交后代中筛选获得了4株异源染色体植株，其叶片在离体条件下对黑胫病具有较强抗性，其中一株仅携带1条N.plumbaginifolia染色体，可能为异源单体代换系。

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Preliminary report on selection of black shank resistant plants with alien chromosomesfromNicotiana tabacum-N. plumbaginifoliabackcross generations

DANG Jiangbo1, LIANG Guolu1, GUO Qigao1, XIANG Suqiong1, SUN Haiyan1, HE Qiao1, YANG Chao2, CHEN Yiyin2
1 College of Horticulture and Landscape, Southwest University, Chongqing 400716, China;2 Tobacco Research Institute, Chongqing Municipal Tobacco Corporation, Chongqing 400716, China

To obtain strong black shank resistant plants with alien chromosomes inNicotiana tabacum-N. plumbaginifoliabackcross generations, 120 plants were primarily screened byin vitroleaf infection method, and plants without scabs and with smaller scabs on leaf were selected in the fi rst screening, plants without scabs and with smaller scabs on the leaves were investigated by genomicin situhybridization (GISH) in the second screening. 5 plants without scabs on leaf and 8 plants with smaller scabs on leaf were found during the fi rst screening, and 4 plants without scabs on leaf and 1 plant with smaller scabs on leaf were found in the second screening. GISH results showed that there were 1-4 chromosomes fromN. plumbaginifoliagenome in 4 plants without scabs on leaf, and noN. plumbaginifoliachromosomes in plant with smaller scabs on leaf. Leaves resistance to black shank of these 5 plants were selected to be investigated by GISH and were testedin vitroagain, presenting similar results to that of second screening. Thus, 4 tobacco plants with leaf that highly resistant to black shank, were obtained inNicotiana tabacum-N. plumbaginifoliahybrid BC1 plants, and they had 1-4 alien chromosomes,and one of them could be monosomic alien substitution plant.

N. tabacum;N. plumbaginifolia; leafin vitro; black shank resistance; monosomic alien substitution lines

中国烟草总公司重庆市公司资助项目（No: 2012044）

党江波，博士研究生，主要从事烟草细胞遗传学研究，Email：dangjiangbo@126.com

梁国鲁，主要从事细胞遗传及生物学研究，Email：lianggl@swu.edu.cn

2016-01-19

党江波，梁国鲁，郭启高，等.Nicotiana tabacum-N. plumbaginifolia杂种回交后代中筛选抗黑胫病异源染色体植株初报[J]. 中国烟草学报，2016,22（4）

:DANG Jiangbo, LIANG Guolu, GUO Qigao, et al. Preliminary report on selection of black shank resistant plants with alien chromosomesfromNicotianatabacum-N.plumbaginifoliabackcross generations [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(4)