液相色谱荧光检测水产品中隐色孔雀石绿残留的方法

郭 睿　曹院章　唐艳荣　王艳红　王丹怡　詹颖洁

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京　100018）

液相色谱荧光检测水产品中隐色孔雀石绿残留的方法

郭 睿曹院章唐艳荣王艳红王丹怡詹颖洁

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京100018）

本文概述了隐色孔雀石绿残留检测的液相色谱荧光检测方法，在实验过程中出现问题的查找步骤与实验设计，进一步解析了该实验操作，为实验室检测方法的实施与改进提供参考。

隐色孔雀石绿查找步骤实验设想

孔雀石绿（Basic Green 4）作为抗真菌剂，是抗外生性寄生虫药和消毒剂，被广泛使用于鱼类养殖业中。但是，研究显示，孔雀石绿具有三致作用，进入人类或动物机体后，可以通过生物转化，还原代谢成脂溶性的隐色孔雀石绿，具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变作用，严重威胁人类身体健康，因此，孔雀石绿在水产养殖业中禁用。

1　实验设计

本实验室于2012年成功增项《GB/T20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》，自此该项目成为实验室重点监测项目，“两会”水产品特供保障项目。

自从2016年3月开始，该项目的检测谱图出现了明显的异常，每批次检测样品的质控样品回收率无法达标，而且谱图杂乱，噪音很高，检测结果无法保证准确度。该项目只能暂时拿下，查找原因，验证后，才能重新投入检测。

2　出现问题的原因分析

2.1 检测仪器

直接配制对照标准点，实验室平时验证标准溶液均使用10μg/kg浓度的隐色孔雀石绿。在现有仪器waters e2695+2475和waters 2695+2475上进行仪器比对，结果发现，两台仪器响应值均出现降低的现象。于是按照仪器清洗程序进行维护，分别用稀硝酸和异丙醇冲洗管路过夜，经过10μg/kg标准溶液比对，waters e2695+2475性能恢复，色谱峰响应值可以达到初始状态。waters 2695+2475系统老化，无法达到信号响应强度，提交申请向仪器厂家报修，仪器更改相应状态标识。详见图1。

图1　e2695+2475标准曲线

从图中可以看出，性能恢复的waters e2695+2475检测标准曲线，r2=0.999582，最低检出限为0.5μg/kg，可以确定检测仪器没有问题。

2.2检测试剂

重新领用未开封的实验涉及的试剂，仔细核对，重新配制相关溶液，注意每一个环节，严格操作。使用新配制的试剂重新进行质控实验，采集数据，计算空白样品添加回收率，结果发现实验结果仍旧异常。详见图2。

图2 自动标尺色谱图

此次试验操作规范，实验过程中未发生异常，可以确定检测试剂和实验方法没有问题。

2.3样品提取步骤

使用重新配制的溶液，注意每一个环节，规范操作，重新进行质控实验，提取的样液浓缩后不经过净化，直接溶解上机检测，采集数据，计算空白样品添加回收率，结果发现提取液中有隐色孔雀石绿残留检出，回收量在合格范围内。详见图3。

图3 自动标尺色谱图

此次试验使用的相关设备和玻璃器具均不会出现异常，可以确定样品提取过程没有问题。

2.4样品净化步骤

使用固相萃取装置，直接用10g/kg标准溶液（基质为乙腈）分别过酸性氧化铝柱和PRS柱，分别接取过柱液、淋洗液、洗脱液，直接上机检测，采集数据，结果发现隐色孔雀石绿在酸性氧化铝过柱液中几乎全部流出无保留，在过PRS柱后无法检测出隐色孔雀石绿。详见图4。

过酸性氧化铝柱的过柱液

图4 自动标尺色谱图

过PRS柱的洗脱液

图5 自动标尺色谱图

此次试验可以肯定是净化步骤出现问题。

（1）直接使用10g/kg标准溶液（基质为乙腈）过PRS柱后无法在过柱液、淋洗液、洗脱液中检测出，首先怀疑是PRS柱异常。现在使用的PRS柱是Agilent公司的，于是从其他实验室借来了VARIAN的PRS柱，使用固相萃取装置，直接用10g/kg标准溶液（基质为乙腈）分别过酸性氧化铝柱和PRS柱，分别接取过柱液、淋洗液、洗脱液，直接上机检测，采集数据，结果发现隐色孔雀石绿在Agilent PRS柱和VARIAN PRS柱的洗脱液中均无法检测出隐色孔雀石绿。详见图6。

过Agilent PRS柱的洗脱液

图6　自动标尺色谱图

过VARIAN PRS柱的洗脱液。

此次试验可以排除PRS柱的厂家差异，问题查找进入了瓶颈期。

（2）为了确定隐色孔雀石绿残留的去向，于是设计直接采用液相方法的PRS柱后过柱液、淋洗液、洗脱液上液相色谱串联质谱检测器，确定是否含有隐色孔雀石绿，结果发现隐色孔雀石绿就残留在洗脱液中。详见图8。

图8　自动标尺色谱图

此次试验可以确定是净化步骤的洗脱出现问题。

（3）洗脱过程排除了试剂问题、固相萃取柱问题、实验方法问题，还会涉及的只有固相萃取装置，于是直接使用10g/kg标准溶液（基质为乙腈）自然过PRS柱，过柱过程中只会采用吸耳球手工吹打，收集柱后过柱液、淋洗液、洗脱液，上机检测，采集数据，结果发现洗脱液中隐色孔雀石绿几乎全部洗脱无保留，色谱峰峰型良好。详见图9。

图9　自动标尺色谱图

此次试验可以确定是固相萃取装置管路年久老化，在洗脱过程中溶解了杂质，造成色谱图基线响应值过高，掩盖了目标峰的信号。

3　结语

通过此次实验事故问题的查找步骤，更加系统地学习了《GB/T20361-2006水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法》，增长了经验，也深切体会了日常仪器设备的维护和自检的重要性。希望通过我实验室的这次常规检测项目问题查找步骤，可以给同行们的工作一些参考建议。实验室技能的日益提高，不排除会出现各种各样的问题，检测工作的严谨性要求我们面对任何异常不得不求甚解，问题的出现是我们提高技术的契机。

图7　自动标尺色谱图

郭睿（1981-），职称:中级兽医师，研究方向:实验室管理及检测。

曹院章（1966-），职称:中级兽医师，研究方向:检疫及兽药残留检测。