黑头萨福克绵羊胚胎玻璃化快速冻胚移植效果分析

吐尔洪·阿木提阿布力孜·吾斯曼宋玉坤张效生王旭光何长久傅祥伟朱士恩张金龙*刘国世，*

（1.新疆阿克苏市畜禽育种改良站，新疆阿克苏 843000；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；3.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 8300522；4.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

黑头萨福克绵羊胚胎玻璃化快速冻胚移植效果分析

吐尔洪·阿木提1阿布力孜·吾斯曼3宋玉坤2张效生4王旭光3何长久2傅祥伟2朱士恩2张金龙4*刘国世2，3*

（1.新疆阿克苏市畜禽育种改良站，新疆阿克苏 843000；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193；3.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 8300522；4.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381）

本试验应用玻璃化胚胎冷冻方法进行黑头萨福克绵羊胚胎冷冻和移植，比较了受体羊卵巢上黄体数量、受体羊的体况、移植胚胎的数量对受体受胎率的影响。受体羊卵巢上有一个黄体的移植受胎率42.7%与有2～3个黄体受体羊移植受胎率44.4%无显著差异；受体的体况对受胎率有显著影响，中上等（含中等）体况水平的受体的受胎率47.2%显著高于中下等的受体的受胎率43.0% （P＜0.05）；使用玻璃化胚胎冷冻法的冷冻解冻胚胎移植受胎率54.2%显著高于常规胚胎冷冻法的冻胚移植受胎率44.0%（P＜0.05）；移植1枚桑葚胚（1M）的受胎率47.5%略高于移植1枚囊胚（1B）的受胎率44.3%（P＞0.05）。因此，受体羊黄体数、冷冻桑葚胚和囊胚对胚胎移植受胎率没有显著影响，而受体中上等（含中等）体况水平和玻璃化胚胎冷冻法冷冻解冻胚胎移植受胎率显著提高。

绵羊胚胎玻璃化冷冻胚胎移植胚胎阶段受胎率

胚胎的冷冻保存是动物繁殖及生物工程的关键应用技术之一。将质量较好的胚胎进行冷冻保存，同期发情后胚胎移植技术的结合，不仅可以起到保存濒危动物的品种，还可以使动物引种不再受地点和时间条件的局限，提高了胚胎移植的推广应用。玻璃化冷冻是继程序化冷冻之后发明的一种简单高效的冷冻方法，无须经历缓慢的程序化降温过程，细胞在玻璃化液中短暂处理后直接投入液氮冷冻即可。玻璃化冷冻相对程序化冷冻大大降低昂贵的冷冻仪，冷冻过程耗时较短，便于推广应用。新疆阿克苏地区，近几年逐步加大了对当地多浪羊的改良力度，于2015 年利用当地的多浪羊做受体进行胚胎移植，生产优质种羊，向农牧民提供质优价廉的种公羊。本文旨在通过试验探讨受体羊的饲养管理水平、胚胎胚龄、胚胎冷冻方法等因素对多浪羊胚胎移植受胎率的影响，为今后胚胎移植技术在该地的推广、提高胚胎移植受胎率提供参考。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1时间和地点

本试验于2015年在新疆阿克苏富民养殖场进行。

1.1.2受体母羊的准备与饲养管理

本试验选用新疆当地品种年龄1.5～4岁的多浪羊。所有的试验羊已经做过预饲养、驱虫、免疫，体格健壮，无遗传及传染性疾病、寄生虫病、生殖系统疾病等，具有正常发情周期。受体羊在舍饲情况下要保证有良好的体况。

1.1.3药品与试剂

促卵泡素（FSH）：三生药业有限公司

促黄体激素释放激素（A3）：三生药业有限公司

孕马血清促性腺激素（PMSG）：三生药业有限公司

阴道栓（CIDR）：新西兰CIDR，20个/袋

Holding培养液：新西兰生产，50ml/袋

0.5mol/L蔗糖液：美国ICP公司生产，6ml/支

玻璃化冷冻液：实验室自配

酒精、碘酒、新洁尔灭、抗生素、生理盐水、青霉素、链霉素等为国产。

1.1.4设备及器械

胚胎移植针，细菌滤器，体视镜，恒温台，水浴锅等。

1.2实验方法

1.2.1玻璃化胚胎冷冻保存及解冻方法

（1）冷冻：胚胎首先在10%EG或10%EG+10%D预处理液中平衡5min，然后针用捡卵将胚胎移进事先装好玻璃化溶液的0.25ml塑料细管内，平衡30s后投进液氮容器内冷冻保存。

（2）解冻：在25℃室温下，将装有胚胎的细管从液氮中取出，迅速放入25℃水浴中平行晃动10s，待细管内蔗糖部分由乳白变为透明时，取出细管，搽去细管表面的水珠，剪掉两端口，将细管内的液体推入0.5mol/L蔗糖液的表面皿中，在实体显微镜下找到胚胎，并将胚胎移入放有0.5mol/L蔗糖液的平皿中平衡5.0min去除抗冻保护剂，最后用PBS液洗净胚胎，移入Holding液中等待移植。

1.2.2受体羊同期发情方法

多浪羊受体在发情周期任意一天放置CIDR，第13d注射PMSG，同时取出CIDR，并进行记录。受体羊发情后用腹腔内窥镜法进行冷冻胚胎移植，见表1。

表1　受体羊冷冻胚胎移植方案

1.2.3卵巢上黄体个数对冷冻胚胎移受胎率的影响

多浪羊受体选择要求健康，无繁殖疾病，同期发情前一个月进行补饲，使之达到最佳的生理状态，为保证后期高的同期发情率和受胎率。在试验中比较双侧卵巢上有一个黄体的受体和卵巢上有2-3个黄体对受体移植受胎率的影响。

1.2.4受体的体况对冷冻胚胎移植效果的影响

对本试验选择不同体况的多浪羊受体（中上等、中下等）进行同期发情处理，比较受体体况对冷冻胚胎移植效果的影响。羊的体况按照体重分为中上、中下等体况，体况按照年龄、体重区分见表2。

表2　按照体重划分羊的体况表

1.2.5不同的冷冻方法对胚胎移植效果的影响

本试验选用两种不同冷冻方法生产的冷冻胚胎（常规冷冻法和玻璃化法），胚胎解冻后每只羊移植1枚胚胎，其他条件相同的前提下移植到同期发情处理的多浪羊子宫角内，观察比较其受孕情况。

1.2.6不同胚龄对冷冻胚胎受胎率的影响

本试验选择常规胚胎冷冻法冷冻的冻胚251枚，分别移植给251只多浪受体羊，比较移植1枚桑葚胚和移植1枚囊胚受胎率情况。

1.2.7数据处理

试验数据应用Excel2003软件进行整理，试验结果采用SAS软件中的PROCFREQ统计程序进行数据分析。

2　实验结果

2.1卵巢不同黄体个数对冷冻胚胎移受胎率的影响

本试验比较了多浪羊的双侧卵巢上有1个黄体或有2个及以上黄体，冷冻胚胎移植后受胎率，由表3可知，受体羊卵巢上有1个黄体的移植受胎率42.7%，有2-3个黄体受体羊移植受胎率44.4%，两组受胎率差异不显著（P＞0.05）。

表3 不同黄体个数对冷冻胚胎移受胎率的影响

2.2受体体况对冷冻胚胎移植效果的影响

由表4可见，受体的体况对受胎率有显著影响，中上等（含中等）体况水平的受体的受胎率47.2%显著高于中下等的受体的受胎率43.0%（P＜0.05）。

表4　受体体况对受胎率的影响

2.3不同胚龄对冷冻胚胎受胎率的影响

由表5可知，不同胚龄对冷冻胚胎受胎率有显著影响，移植1枚桑葚胚（1M）的受胎率47.5%略高于移植1枚囊胚（1B）的受胎率44.3%（P＞0.05）。

表5 不同胚龄对冷冻胚胎移植效果的影响

2.4不同的冷冻方法对胚胎移植效果的影响

由表6可见，胚胎冷冻方法对受体的受胎率有显著影响，使用玻璃化胚胎冷冻法的冻胚移植受胎率54.2%显著高于常规胚胎冷冻法的冻胚移植受胎率44.0%（P＜0.05）。

表6 不同的冷冻方法对胚胎移植效果的影响

3　分析与讨论

3.1卵巢不同黄体个数对冷冻胚胎移受胎率的影响

本试验结果表明卵巢上黄体多少不影响移植效果，这与付静涛等（付静涛等，2005）和王素梅（2004）等结果相一致。受体绵羊血浆中的孕激素浓度与黄体的数量有关（Ashworth et al.，1989），孕激素的主要功能是促进胚胎着床并维持受胎（张忠诚，2004）。但受体羊卵巢上的黄体数量对胚胎移植后的受胎率没有显著影响（Bari et al.，2003）。也就是说只要血浆中的孕激素达到了受胎所需的阈值就足以维持受胎了，多了效果也是一样。所以在移植时观察黄体要注重对黄体质量的观察。

3.2受体体况对冷冻胚胎移植效果的影响

受体羊的饲养管理十分重要。受胎率与受体羊的饲养管理有着直接的联系。当胚胎移植时受体羊的体况达到中等以上水平，大部分胚胎能够着床发育成活。营养条件不足，对胚胎着床和产后羔羊的生长不利，显著影响受体胚胎移植效果（张红等，2005）。本试验体况中上等的受体羊的受胎率明显好于中下等体况的受体羊，这一结果与以上等人的研究结果相符合。所以在进行胚胎移植前，先对受体羊进行选择，尽量选择体况好、体质好的青年羊作为受体，以保证较高的受胎率。

3.3不同胚龄对冷冻胚胎受胎率的影响

一般认为处于桑葚胚前的胚胎，移植效果好，受胎率较高。张红等（2001）研究证明，桑葚胚移植受胎率、胚胎存活率均要高于囊胚。也有试验证明，囊胚期是胚胎移植的最佳时间期，且受胎非常高。王丽娟等（2003）认为道赛特等绵羊冻胚移植中，囊胚的受胎率显著高于桑葚胚（P＜0.01）；陈永昌等研究也得出杜泊羊囊胚的受胎率显著高于桑葚胚（P＜0.01）。可是本试验的结果表明，移植1枚桑葚胚（1M）的受胎率47.5%略高于移植1枚囊胚（1B）的受胎率44.3%，但二者差异不显著（P＞0.05），说明胚龄对冷冻胚胎受胎率没有显著影响。

3.4不同的冷冻方法对胚胎移植效果的影响

牛胚胎常规冷冻已经广泛应用于生产中，玻璃化冷冻移植产犊也有报道（saha et al，1996）。牛胚胎的玻璃化冷冻研究表明，第7天扩张囊胚冷冻后可以获得较高的存活率（80%），而桑葚胚冷冻存活率相对较低（62%）（Campos-chillon et al，2006）。eldridge-panuska等（2005）用细管法玻璃化冷冻马胚胎，管内解冻直接移植后获得62%的受胎率，和对照无显著差异。玻璃胚胎冷冻化法优点是不使用冷冻仪，且在室温（20℃～25℃）下徒手操作，仅30s即可完成冷冻程序。而常规胚胎冷冻法，需要借助冷冻仪，冷冻的所耗时间长，且降温过程需1.5h才能完成。尽管国内已有许多玻璃化法冷冻和解冻胚胎的研究，但多数均在实验室范围内的研究，绵羊玻璃化冷冻胚胎应用在生产中报道较少。本试验的结果表明，将玻璃化胚胎冷冻法应用于绵羊冷冻胚胎移植，并且使用玻璃化胚胎冷冻法的冻胚移植受胎率54.2%显著高于常规胚胎冷冻法的冻胚移植受胎率44.0% （P＜0.0 5），所以在今后的胚胎生产中可推广玻璃化胚胎冷冻法进行胚胎冷冻保存。

因此，受体羊黄体数、冷冻桑葚胚和囊胚对胚胎移植受胎率没有显著影响，而受体中上等（含中等）体况水平和玻璃化胚胎冷冻法冷冻解冻胚胎移植受胎率显著提高。

[1]付静涛，朱士恩. 绵羊同期发情与冷冻胚胎移植技术的研究[J］.中国畜牧杂志，2005，41（8）：32-33，57.

[2]朱士恩. 家畜繁殖学（第五版）[M］. 北京：中国农业出版社，2009.

[3]王丽娟，李 武，张广民.优质肉羊冷冻胚胎移植技术的研究 应用[J].上海畜牧兽医通讯，2003，（1）：29.

[4]陈永昌，王 继，和占星，等.杜泊羊冷冻胚胎批量移植试验 [J］.黑龙江畜牧兽医，2004，（10）：32-34.

课题资助：支疆项目（2016E02037）；国家重大专项（2014ZX08008-002B，2013ZX08008—005）；中国农业大学与新疆农业大学合作基金（2015TC050）