NF-BP65和BCL-2蛋白在涎腺腺样囊性癌中的表达与其预后关系的研究

陈昌晖，肖维华

陈昌晖，肖维华

目的探讨NF-BP65与BCL-2蛋白在涎腺腺样囊性癌中的表达意义及与预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测30例涎腺腺样囊性癌组织中NF-BP65与BCL-2蛋白表达水平，以多形性腺瘤、癌旁正常涎腺组织作为对照。结果涎腺腺样囊性癌、多形性腺瘤和正常涎腺组织中NF-BP65表达的阳性率分别为83.3%、33.3%和10.0%，BCL-2表达的阳性率分别为63.3%、26.7%和10.0%，两者表达在肿瘤组与对照组中差异均有统计学意义（均＜0.05）；NF-BP65与BCL-2表达呈正相关关系（=0.712，＜0.05）；NF-BP65、BCL-2表达对腺样囊性癌患者的5年生存率均无明显影响。结论NF-BP65和BCL-2在涎腺腺样囊性癌中均有较高水平表达，在与多形性腺瘤比较中亦有一定鉴别诊断价值，两者表达与腺样囊性癌5年生存率无关。

腺样囊性癌；NF-BP65；BCL-2；免疫组化

涎腺腺样囊性癌（ACC）是一种较常见的涎腺恶性肿瘤，侵袭性强，早期即侵犯神经，易转移和复发。NF-BP65是最先在成熟的B细胞中被发现的一种核转录蛋白［1-2］。BCL-2是迄今研究的最深入和广泛的凋亡调控基因蛋白之一［3］。鉴于此，本研究采用免疫组化SP法检测NF-BP65和BCL-2在ACC、多形性腺瘤（PA）及正常涎腺组织（NSGT）的表达水平，以分析NF-BP65和BCL-2在ACC中的表达情况及意义，同时探讨两者的相关性、可能的机制及对预后的影响。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2006年1月至

2009年12月南昌大学第二附属医院口腔颌面外科收治的涎腺ACC手术患者30例，以切除的ACC组织为实验组。同时收集PA组织30例为肿瘤对照组，NSGT组织30例为正常对照组。实验组男11例，女28例；年龄14～85岁；发生于腮腺有7例，颌下腺5例，腭部9例，上颌窦4例，舌4例，鼻腔1例；ACC直径＜1cm者15例，＞3cm者6例，介于两者间9例。随访时间以术后第2天开始计算，对患者5年生存情况进行随访，截止日期2014年12月31日。30例ACC除一例失访外，其余29例患者生存时间范围为8～96个月。所有患者术前未进行放化疗治疗。所有标本经病理检查确诊后经10%甲醛固定，常规石蜡包埋。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂小鼠抗人NF-BP65单克隆抗体试剂盒和小鼠抗人BCL-2单克隆抗体试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组织化学染色（EliVisionTM plus二步法）标本制成4 m石蜡切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化和PBS（pH=7.4）冲洗后，切片放入高压锅中进行高温抗原修复，冷却后用PBS液冲洗，室温下孵育10 min，加1滴一抗，置于4℃冰箱内过夜。第2天PBS冲洗结束后，加1滴聚合物增强剂，室温孵育20min。加1滴酶标抗兔聚合物，室温孵育30 min。重复PBS冲洗步骤一次，加1滴新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间。水洗、苏木素复染、0.1%HCL分化和PBS返蓝。切片经酒精脱水干燥、二甲苯透明和树胶封片，最后在显微镜下观察组织。

1.3 免疫组化阳性判断标准NFBP65以胞浆或胞核出现棕黄色颗粒为阳性；BCL-2以胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。以阳性细胞所占比率＜10%判定为阴性（-），10%～25%为弱阳性（+），26%～50%为中阳性（2+），＞51%为强阳性（3+）。弱阳性、中阳性及强阳性均记为阳性。

1.4 统计方法采用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析，计数资料以率表示，采用检验；NF-BP65与BCL-2表达相关性分析采用相关分析；对ACC预后的影响采用单因素生存分析及检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NF-BP65在涎腺ACC、PA和NSGT中的表达NF-BP65在涎腺ACC、PA和NSGT的阳性表达率差异有统计学意义（=27.07，＜0.05）；AAC与PA的阳性表达率差异有统计学意义（＜0.05）；AAC与NSGT的阳性表达率差异有统计学意义（＜0.05）；PA与NSGT的阳性表达率差异无统计学意义（=0.06）。见表1、图1～2。

2.2 BCL-2在涎腺ACC、PA和NSGT中的表达BCL-2在涎腺ACC、PA和NSGT中的表达阳性率差异有统计学意义（=12.51，＜0.05）；AAC与PA表达阳性率差异有统计学意义（＜0.05）；；AAC与NSGT表达阳性率差异有统计学意义（＜0.05）；PA与NSGT表达阳性率差异无统计学意义（=0.28）。见表2、图3～4。

2.3 NF-BP65与BCL-2表达在涎腺ACC中的相关性分析30例涎腺ACC中NF-BP65阳性表达病例中有19例BCL-2蛋白表达阳性；Pearson相关分析显示，NF-BP65与BCL-2表达呈正相关关系（=0.71，＜0.05）。见表3。

2.4 随访资料统计实验组ACC病例除一例失访外，均进行定期随访，随访率为93.5%（29/30），5年累积生存率62.07%（18/29），术后无瘤生存率37.93%（11/29），带瘤生存率13.79%（4/29），复发生存比10.34%（2/29），转移生存比3.45%（1/29）。死亡11例，5年累积病死率为37.93%，中途失访病例不计入预后因素统计范围。

2.5 单因素生存分析

2.5.1 NF-BP65表达与涎腺ACC预后的关系对2例随访病例进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示：随访期内NF-BP65表达阴性患者平均生存期为（67.0±7.6）个月，中位生存期为（59.0±7.5）个月；95%分别为（52.0～82.0）和（44.3～73.70）个月。NF-BP65表达阳性患者平均生存期为（50.3±5.0）个月，中位生存期为（56.0±7.5）个月；95%分别为（40.5～60.2）和（41.3～70.7）个月。单纯NF-BP65表达阳性与阴性5年生存率差异无统计学意义（=0.45）。见图5。

2.5.2 BCL-2表达与涎腺ACC预后的关系BCL-2表达阴性患者平均生存期为（63.4±6.7）个月，中位生存期为（64.0±7.1）个月；95%分别为（50.2～76.6）和（50.0～77.9）个月。BCL-2表达阳性患者平均生存期为（46.9±5.6）个月，中位生存期为（56.0±11.6）个月；95%分别为（35.9～58.0）和（33.2～78.7）个月。单纯BCL-2表达阳性与阴性5年生存率差异无统计学意义（=0.09）。见图6。

3 讨论

NF-BP65是一种功能复杂的核转录因子，参与基因转录的起始调节，与多种趋化、生长和黏附相关的因子有关。同时NF-BP65还参与机体免疫和炎症反应，并在肿瘤细胞凋亡等方面起作用［4］。涎腺ACC可很好地展示涎腺肿瘤细胞结构的复杂性，其不同分化类型表明其初始为一种惰性肿瘤，随着NF-BP65等关键信号蛋白介导的信号通路的激活，其累积的能导致新突变的“土壤”足够富于，ACC的产生、发展级别和危险度可能逐渐增加［5］。本研究观察到NF-BP65在涎腺ACC、PA和NSGT中的表达是存在差异的，提示NF-BP65与ACC是有关的，但与PA相比，发现NF-BP65的表达还是明显高于PA。提示NF-BP65在两种病变中的表达强度和数量存在差异，这与病变所处阶段和严重程度一致。

研究证实许多肿瘤中凋亡相关基因表达异常，主要是抑凋亡基因表达上调，促凋亡基因表达下调［6］。抗凋亡基因BCl-2作为最重要的肿瘤细胞原癌基因之一，能阻断细胞程序化死亡，延长细胞寿命，导致异常细胞的积聚，进而促进肿瘤细胞增殖，而且与肿瘤复发有关［7］。在某些未知的新信号通路的反复介入下，部分出现了特定的基因突变，如野生性P53和BCL-2基因变化。肿瘤逐步进展，发生恶变，这个过程长短不一，也可以一开始就出现ACC或其他恶性上皮性肿瘤。

图1 NF-BP65在涎腺ACC中以胞浆表达为主，部分可见核浆共表达（Elivision法，×200）

图2 NF-BP65在涎腺PA中表达定位于腺上皮胞浆，沿腺腔规则分布（Elivision法，×200）

图3 BCL-2在涎腺ACC中的表达明显增多，弥漫性分布（Elivision法，×200）

图4 BCL-2在涎腺PA中的表达呈散在局灶表达（Elivision法，×200）

表1 不同组别NF-BP65的阳性表达情况

表2 不同组别BCL-2的阳性表达情况

表3 NF-BP65与BCL-2表达的相关性

图5 NF-BP65表达与5年生存率

图6 BCL-2表达与5年生存率

NF-BP65和BCL-2蛋白介入的两种干预机制是否存在相关性，国内外文献尚未给出明确答案，这也是本研究设立的初始动机。本文结果显示NF-BP65与BCL-2表达呈正相关关系（=0.71，＜0.05），表明两者与涎腺ACC中存在协同作用。NF-BP65可以通过对凋亡蛋白和抗凋亡蛋白不平衡表达的调节作用，实现抗凋亡功能。NF-BP65所介导的对自我吞噬作用的抑制效应，是其发挥抗凋亡作用的新机制［8］。

NF-BP65和BCL-2是否可以作为恶性肿瘤判断预后的指标仍充满争议。尤金强等［9］则认为BCL-2蛋白表达强度越强，临床预后可能越佳，这与本实验结果是不一致的。而尹万忠等［10］研究表明BCL-2蛋白表达仅与ACC的临床分期正相关，但与预后无明显相关，与本研究结果较为吻合。但通过生存曲线的观察，笔者还是发现BCL-2阳性表达可能偏向具有较好的5年生存率，但数据否认了这种直观印象，即使单因素P值为0.09已经接近差异性统计学标准。NF-BP65和BCL-2蛋白在改善ACC患者的预后可能有一定协同作用。由此导致的细胞周期延长可能会延缓细胞增殖，在生存曲线上则表现为非统计差异性曲线左移。

综上所述，本研究结果证实NFBP65和BCL-2在涎腺ACC中有较高水平的表达，提示两者与涎腺ACC发生和进展有关。此外，两者可为鉴别涎腺ACC和涎腺实体型或筛状结构的PA提供一定的参考依据。遗憾的是，NFBP65和BCL-2蛋白表达与涎腺ACC的预后无明显相关性，间接验证了单因素调节对预后影响的局限性。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.03.059

R734.2

A

1671-0800（2016）03-0393-03

2015-05-18

（本文编辑：陈志翔）

浙江省卫生厅一般项目（2012KYB188）

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陈昌晖，Email：ccchzr91@ 163.com