洛氏鱥非脱羧勒克菌的分离鉴定与药敏试验

巴翠玉，赵福广，张培军，张林波，王建超，李月红

（1.吉林农业大学，吉林 长春 130118；2.吉林省卫生监测检验中心，吉林 长春 130000）

洛氏鱥非脱羧勒克菌的分离鉴定与药敏试验

巴翠玉1，赵福广1，张培军2，张林波1，王建超1，李月红1

（1.吉林农业大学，吉林 长春 130118；2.吉林省卫生监测检验中心，吉林 长春 130000）

本试验旨在从患病洛氏鱥的鳃及内脏等病灶部位分离病原菌，并对其进行鉴定。采用革兰染色的方法观察其为短杆状、两端钝圆的革兰阴性菌，利用法国梅里埃公司生产的VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行生化鉴定及药敏试验分析，结果为非脱羧勒克菌，其对阿米卡星和亚胺培南等21种药物敏感。后进行回归试验发现死亡率为54.4%危害较大。因鱼类中发现非脱羧勒克菌较少，所以本文对于鱼类非脱羧勒克菌的研究有重要意义。

洛氏鱥；非脱羧勒克菌；分离鉴定；药敏试验

洛氏鱥在鱼类分类学上属鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科、鱥属，渔民常称为柳根池［1-3］。主要分布于新疆北部、黑龙江及吉林流域。因其抗寒性强、食性杂、适应范围广，适合大规模养殖。随着养殖规模的不断扩大，各种病害也层出不穷，给养殖户带来了严重的经济损失，但关于洛氏鱥疾病研究的报道却很少。非脱羧勒克菌是勒克菌属中惟一的菌种，是一种条件致病菌，随着临床上的报道增多而被人们关注［4］。被从人类的血液、腹泻患者粪便和腹膜透析液中检出，在食品及药品中也有发现，但是在鱼类及其他动物中报道较少。2004年黄宁［5］等从马尾口岸饲料用鱼粉中检出4株非脱羧勒克菌。2014年刘溪源［6］等从牛患乳房炎乳样中检出非脱羧勒克菌。目前尚未有文献报道非脱羧勒克菌对洛氏鱥的危害。本试验从患病洛氏鱥中分离到一株非脱羧勒克菌，进行药敏试验，筛选了防治药物，为预防和治疗非脱羧勒克菌引起的洛氏鱥类疾病提供了一定的参考依据。

1　材料与方法

1.1材料试验用发病洛氏鱥，采自吉林省某渔场，症状表现为腹部肿胀。剖检鱼，发现鳃上有黏稠状粉红色液体，有的鳃丝发白，胆囊肿大呈墨绿色，肝胰脏充血。试验用健康洛氏鱥，购自吉林省金龙渔场。

1.2方法

1.2.1病原菌的分离在无菌的超净工作台上将具有典型自然发病症状的濒死洛氏鱥，用75%酒精棉球反复擦拭体表，无菌操作取其鳃部及内脏等病灶部位，制成匀浆。将匀浆稀释成不同浓度，用微量移液器取200 μL匀浆，涂布棒涂布到麦康凯琼脂平板上，30℃条件下培养24 h后观察菌落生长状态。挑取优势菌落进行多次划线纯培养，待菌落形态生长一致时，挑取单菌落用80%甘油对其进行菌落的保藏，为后续试验做准备。

1.2.2病原菌的鉴定

1.2.2.1革兰染色法无菌条件下洁净的载玻片滴少许生理盐水，用接菌环将分离纯化后的菌株均匀的涂布到载玻片上，干燥固定，后用结晶紫染液初染、碘液煤染、酒精脱色、番红染液复染后镜检。

1.2.2.2生化鉴定采用法国梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行鉴定，鉴定板为革兰阴性菌鉴定板，结合生物梅里埃公司的API-细菌鉴定系统API20E进行生化反应测试。试验周期结束后观察试验结果并分析。

1.2.2.3药物敏感试验采用法国梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行鉴定，鉴定板为革兰阴性菌药敏板，试验周期结束后观察试验结果并分析。

1.3.2.4回归试验将分离的菌株接种于营养琼脂斜面上，30℃培养16 h后制成菌悬液，调整菌液浓度为1×108CFU/mL，进行人工感染以确定病原菌。选用驯化后的体格健壮、规格整齐、游动活跃，平均初体重为（35±0.5）g的当年洛氏鱥120尾。随机分为4组，1组对照组，其余3组为试验组。将4组鱼同时放入相同水环境不同鱼缸中。通过腹腔注射法进行攻毒，对照组每条鱼注射无菌生理盐水0.1 mL，试验组每条鱼注射菌悬液0.1 mL。22℃水温下饲养7 d，观察洛氏鱥发病及死亡状况，并记录。再取病死洛氏鱥的鳃及内脏等病灶部位进行病原菌的分离及鉴定。

2　试验结果

2.1病原菌分离及革兰染色结果从发病洛氏鱥的病灶部位分离出1株优势菌株，30℃培养24 h，在麦康凯琼脂培养基平板上菌落呈圆形，光滑湿润，边缘整齐，中央微隆起，半透明，乳白色。显微镜下可以观察到颜色为红色，杆状，两端钝圆，单个排列，为革兰阴性菌，结果如图1。

图1　革兰染色结果

2.2生化鉴定结果结果如表1，经过法国梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行鉴定，可知该菌与侧金盏花醇、D-葡萄糖和D-甘露糖等21项指标反映呈阳性，与蔗糖、组氨酸同化和氨基乙酸芳胺酶等25项指标反映呈阴性。综上所述，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》（第8版），确定菌株为非脱羧勒克菌，鉴定可信度为99%。

表1　药敏试验结果

2.3药物敏感试验结果经过法国梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行鉴定，结果如表2，药敏试验判定参照美国临床实验室标准化委员会VET01-A4标准［7］，这株菌对氨苄西林、安曲南及其他19种药物全部敏感。

2.4回归试验结果结果如表2，分离菌株注射感染24 h后，洛氏鱥开始食量下降，游动迟缓，3 d后开始出现死亡。7 d后，对照组一切正常，没有发现死亡；注射浓度为1×108CFU/mL的菌悬液0.1 mL的3个试验组中洛氏鱥的死亡率为54.4%。分别从3个试验组各随机挑取一条感染死亡的洛氏鱥，症状表现为腹部肿胀。剖检鱼，发现鳃上有黏稠状粉红色液体，有的鳃丝发白，胆囊肿大呈墨绿色，肝胰脏充血。取其内脏及鳃等病灶部位进行细菌的再分离，对分离出的菌株进行革兰染色和生理生化鉴定，结果同从自然发病鱼体分离的株菌完全一致为非脱羧勒克菌，证明非脱羧勒克菌是该次疾病的病原菌。

表2　回归试验结果

3　讨论

本试验首次从患病洛氏鱥分离出非脱羧勒克菌，该菌使洛氏鱥腹部肿胀。剖检鱼，发现鳃上有黏稠状粉红色液体，有的鳃丝发白，胆囊肿大呈墨绿色，肝胰脏充血。30℃条件下培养24 h该菌在麦康凯琼脂培养基平板上菌落呈圆形，光滑湿润，边缘整齐，中央微隆起，半透明，乳白色。与宋燕［8］等从腹透液中分离到的非脱羧勒克菌在麦康凯培养皿上菌落形态有所不同。原因可能为不同源分离到的非脱羧勒克菌故在麦康凯培养皿上有所差异，也可能为培养的温度及时间等条件不同所以菌落形态存在差异。革兰染色结果为杆状，两端钝圆，单个排列的革兰阴性菌，此结果和梁炯芳［9］的基本相同。

生化鉴定结果得到该菌与侧金盏花醇、D-葡萄糖和D-甘露糖等指标反映呈阳性，表明该菌能发酵或利用这些物质；与蔗糖、组氨酸同化和氨基乙酸芳胺酶等指标反映呈阴性。确定菌株为非脱羧勒克菌，鉴定可信度为99%。与陈燕［10］等同样用法国梅里埃公司VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统鉴定结果相同。

回归试验结果发现其死亡率达54.4%，对鱼类危害严重。本试验对其进行了药敏试验，发现其对亚胺培南、美洛培南、左氧氟沙星和环丙沙星等21种药物高度敏感。与吴尧兰［11］等从腹膜透析液中检出非脱羧勒克菌1例的药敏结果相符合。与王迁［12］等从血液标本中分离到的1株非脱羧勒克菌药敏结果有些差异。没有产生耐药性的原因可能是因为养殖过程中没有大量的使用抗生素药物，而且不同地区、不同源的非脱羧勒克菌的药物敏感程度也是有差异的，所以我们在用药时应根据发病区菌株的药敏试验结果来进行用药或用一些中草药和益生菌制剂来预防鱼病的发生，避免耐药性的产生。本试验最终确定该病原菌为非脱羧勒克菌，但该菌的耐药性机制还未彻底研究清楚，耐药基因存在于质粒或染色体上我们还不清楚，可不可以结合方式在各菌种、动物及人类之间传播均有待于进一步的探究，本试验对吉林省非脱羧勒克菌感染洛氏鱥发病的治疗提供了一定的实验数据和理论基础，对其养殖具有一定的指导，可为后面的研究提供一定的参考，具有一定的理论意义。

［1］张觉民.黑龙江鱼类志［M］.哈尔滨：黑龙江科学出版社，1995：50-52.

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［4］Mazzariol A，Zuliani J，Fontana R，et al.Isolation from blood culture of aLeclercia adecarboxylata strain producing an SHV-12 extendedspectrum blactamase［J］.J Clin Microbiol，2003，41：1738-1739.

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［7］Clinical and Laboratory Standards Insitue Performance standards for antimicrobial sus-ceptibility testing approvedstandard［M］.CLSI Document.2012：M100-S22.

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［12］王迁，马金群.从血液标本中分离到1株非脱羧勒克菌［J］.中华医院感染学杂志，2008，04：578.

Isolation，identification and drug sensitivetest ofLeclercia adecarboxylatafromPhoxinus lagowskii Dybowskii

BA Cui-yu1，ZHAO Fu-guang1，ZHANG Pei-jun2，ZHANG Lin-bo1，WANG Jian-chao1，LI Yue-hong1
（1.Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Jilin Province Health Surveillance Inspection Center，Changchun 130000，China）

The purpose of this experiment was to isolate pathogenic bacteria from Lesion of gill and viscera of the diseased of Phoxinus lagowskii Dybowskii，and to identify them.The Gram staining method was used to observe the short and rounded at both ends of the gram negative.The production of the French Merieux VITEK 2 compact automatic bacteria identification system was applied for biochemical identification and susceptibility test analysis.The results showed that the bacteria were Leclercia adecarboxylata and were sensitive to 21 kinds of drugs including imipenem and amikacin.After the regression test，the mortality rate was 54.4%.Leclercia adecarboxylata found in fish was rare.Thus，our findings about fish Leclercia adecarboxylat is important.

Phoxinus lagowskii Dybowskii；Leclercia adecarboxylata；isolation and identification；drug sensitivity test

LI Yue-hong

R 37

A

0529-6005（2016）09-0099-03

2016-01-18

国家自然科学基金（30972191）；农业部948项目（2014Z34）；吉林省留学人员创新创业项目（201523）

巴翠玉（1992-），女，硕士，主要从事分子病原微生物学与分子免疫学研究E-mail：bacuiyu@163.com

李月红，E-mail：liyhong@sina.com