甘肃临夏绵羊双腔吸虫的感染与鉴定

岳东梅，王金磊，马　君，黄思扬，朱兴全，王春仁

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃 兰州 730046）

甘肃临夏绵羊双腔吸虫的感染与鉴定

岳东梅1，2，王金磊2，马君2，黄思扬2，朱兴全2，王春仁1

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃 兰州 730046）

为调查甘肃省临夏回族聚集地中绵羊双腔吸虫的自然感染情况，有效地指导防治工作，选取了具有代表性的屠宰场进行调查。首先经过形态学观察，对疑似病原进行分离，再通过PCR方法及DNA测序来鉴定。形态鉴定结果表明，在350只绵羊中共发现8只绵羊感染了双腔吸虫，分子生物学鉴定结果表明，这8只绵羊感染的双腔吸虫均为矛形双腔吸虫。

双腔吸虫；调查；临夏回族自治州；分离；鉴定

双腔吸虫病是由矛形双腔吸虫（Dicrocoelium dendriticum）、东方双腔吸虫（Dicrocoelium orientalis）或中华双腔吸虫（Dicrocoelium chinensis）寄生于反刍动物牛、羊、骆驼和鹿的胆管和胆囊内引起的。双腔吸虫也可感染马属动物、猪、犬、兔、猴及其他动物，偶见感染人［1-3］。

该病分布较广，其流行与陆地螺和蚂蚁的广泛存在有关，在我国各地都有发生，尤其西北诸省区和内蒙古流行严重，能引起胆管炎、肝硬变，并导致代谢障碍和营养不良，对养殖业造成巨大损失［2，4］。因此，有效的防制此病对畜牧业生产、保护公共环境、预防和控制人畜共患寄生虫病有重要意义。

1997年王佩雅等报道的甘南牧区绵羊中吸虫感染情况［5］、1999年朱瑗、张思明报道的甘肃定西羊矛形双腔吸虫感染情况［6］、2008年陈亮等报道的兰州的羊矛形双腔吸虫的感染情况［7］均采用形态学观察并报道的。但传统的诊断方法无法鉴别形态极其相似种。近年来PCR技术广泛运用于寄生虫的鉴定，根据ITS序列来进行PCR扩增能够检测双腔吸虫幼虫［8］。为了调查甘肃省临夏地区绵羊双腔吸虫的感染情况，我们选取了两个具有代表性的绵羊屠宰场进行调查，期望获得该牧区的双腔吸虫的流行趋势，制定出相应的防控策略，对羊健康养殖起到指导作用。

1　材料与方法

1.1样品来源甘肃省临夏市某大型绵羊屠宰场和康乐县某绵羊屠宰场分别随机抽取150只和200只绵羊作为调查对象。将待检绵羊逐个剖杀并将病变明显的肝脏收集，低温保存运送到实验室，并对每个有病变的肝脏用剪刀沿肝胆管进行剖检，将收集的双腔吸虫虫体在室温下用生理盐水清洗3次，将自然沉降的、无杂质的双腔吸虫虫体固定于75%酒精中，并置于-20℃冰箱内保存备用。

1.2引物合成与稀释采用我们实验室先前报道的吸虫ITS序列通用引物NC5（5′-GTA GGTGAA CCT GCG GAA GGA TCA TT-3′，26 bp）和NC2（5′-TTA GTT TCT TTT CCT CCG CT-3′，20 bp）序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成（每管1OD）。合成的引物于室温下，6 000 r/min离心5 min，加入所需灭菌超纯水，充分混匀后于-20℃冰箱内保存备用。

1.3虫体DNA的提取按照基因组DNA抽提试剂盒（WizardRSV Genomic DNA purification system，Promega，USA）的使用说明书提取虫体DNA，将提好的虫体DNA置于4℃或-20℃冰箱内储存备用。

1.4核糖体ITS序列的PCR扩增用引物NC5和NC2对虫体的ITS基因进行PCR扩增。扩增体系为25 μL，含12.5 μL Premix Ex Taq，上下引物（50 μmol/mL）各0.5 μL，DNA模板1 μL，灭菌水10.5 μL。预期片段大小为1 200 bp。PCR反应条件如下：94℃预变性5 min，94℃变性2 min，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃延伸10 min。扩增完毕后，取5 μL PCR产物，用凝胶电泳检测（1%琼脂糖凝胶，溴化乙锭染色）后，凝胶成像系统照相，并记录结果。

1.5PCR产物胶回收与纯化经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将与目的片段大小相符的PCR产物进行胶回收纯化，具体操作步骤按照OMEGA Gel Extraction Kit试剂盒使用说明书进行。将纯化好的PCR产物置于4℃或-20℃储存备用。

1.6测序与分析将目的片段的胶回收产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序，然后拼接。将拼接后的序列通过NCBI上进行Blast比对及软件分析，来判断该双腔吸虫是中华双腔吸虫、东方双腔吸虫还是矛形双腔吸虫。

2　结果

2.1剖检结果对上述两个绵羊屠宰场共350只绵羊的肝脏进行调查。临夏市大型绵羊屠宰场的150只绵羊中发现有病变的肝脏10只，进一步检测未发现双腔吸虫的感染。康乐县绵羊屠宰场的200只绵羊中，发现有病变的肝脏15只，进一步检测发现8只绵羊的肝脏感染并分离获得了双腔吸虫虫体。此结果表明，临夏回族自治区双腔吸虫的平均感染率较低，仅为2.3%。

2.2PCR扩增结果双腔吸虫有3个种，单从形态上很难区分，最有效最可靠的方法是分子生物学方法，用引物NC5和NC2对随机选取的5条双腔吸虫的TS基因序列进行扩增，经1%凝胶电泳检测，扩增出主条带大小为1 200 bp左右，与目的条带预期大小一致（如图1）。

图1　双腔吸虫ITS基因序列PCR鉴定结果

2.3DNA测序结果将从测序公司得到的测序结果比对拼接，获得准确序列并在NCBI上Blast比对，结果表明，5个PCR样品的序列均与矛形双腔吸虫ITS序列的匹配率达到100%。因此判定本次分离得到的双腔吸虫全部为矛形双腔吸虫。

3　讨论

双腔吸虫病主要感染反刍动物且流行范围较广，常与肝片吸虫混合感染，造成更大的经济损失。近年来对双腔吸虫病的研究非常少，因此对其目前的流行情况几乎没有了解。在甘肃地区少数民族较多，尤其是穆斯林较多，养羊业对该地区的经济发展起到很重要的作用，因此全面了解羊寄生虫的感染形势对养羊业的健康可持续发展具有重要的意义。

本次调查结果表明，甘肃省临夏回族自治区绵羊双腔吸虫感染率为2.3%。通过分子生物学方法鉴定分离的虫体全部为矛形双腔吸虫。该结果与1997年王佩雅等在甘南调查的结果一致［5］，说明近20年来在甘肃地区主要以矛形双腔吸虫的感染为主。相比1999年定西地区羊矛形双腔吸虫感染率（76.4%）［6］，临夏地区2015年的感染率下降了约33倍。造成这些差异的原因可能有地理位置和环境的不同，临夏州地处青藏高原与黄土高原过渡地带，境内山谷多，平地少，平均海拔2 000 m，由于海拔较高、气候变化较大，双腔吸虫尾蚴和螺的生长繁殖的自然条件较差；对于1997年的结果来说，低感染率也说明了我们羊养殖水平的不断提高。而我们此次的调查结果高于2008年兰州地区的感染率0.38%［7］，这也说明在临夏地区尤其是康乐县，其紧邻洮河，洮河水位近年来不断下降，在洮河沿岸形成不少低洼湿地，这一变化适宜双腔吸虫的中间宿主螺的生长。而兰州附近的郊区这种环境相对较少，且兰州附近羊场的卫生及防控措施更加到位，减少了双腔吸虫的传播。

传统的诊断方法主要根据形态学特征进行粪便中虫卵的显微观察和肝脏中成虫的检查，无法鉴别形态极其相似种。本试验调查除用形态学方法外，还采用了分子生物学方法对其种类进行了鉴定，其较普通鉴定方法更加的敏感、特异、准确，其结果更加可靠。

本次调查临夏地区绵羊双腔吸虫的感染率较低，说明近年来对该病的防控措施到位，但该疾病并没有消失，因此仍需加强环境卫生和饲养管理，放牧应尽可能避开潮湿低洼地带［9］。同时要灭螺，建立清洁的饮水地点，合理补充精料和矿物质，提高畜体自身的抵抗力。

对临夏回族自治州绵羊双腔吸虫感染情况的调查这是首次报道，临夏地区所处的位置介于甘南与兰州之间，对该地区寄生虫疾病的良好监控也具有重要的意义，能够掌握该地区双腔吸虫地流行情况，为兰州地区的公共卫生防控提供重要的理论依据及数据支撑。

［1］阚立抒，何昕，胡志广.中华双腔吸虫形态学特性［J］.畜牧兽医科技信息，2007（10）：22-22.

［2］牛术华.双腔吸虫病的防控［J］.Animal Husbandry and Feedence，2010，31（11）：186-187.

［3］Farid H.Human infection with Fasciola hepatica and Dicrocoelium dendriticum in Isfahan area，Central Iran［J］.Journal of Parasitology，1971，57（1）：160-160.

［4］李敬双，何学佘.矛形双腔吸虫对绵羊感染情况的调查［J］.肉品卫生，1999（04）：4-4.

［5］王佩雅，吕文顺，才学鹏，等.甘南牧区藏系绵羊寄生蠕虫的种类调查和感染季节动态研究［J］.中国兽医科技，1997，27（10）：19-21.

［6］朱瑗，张思明.甘肃省定西地区羊寄生虫感染情况调查［J］.中国兽医科技，1999，29（1）：15-17.

［7］陈亮，窦永喜，田斌，等.兰州地区羊寄生虫感染情况调查及防治策略［J］.甘肃畜牧兽医，2008，38（6）：18-20.

［8］Martínez-Ibeas A M，Martínez-Valladares M，González-Lanza C，et al.Detection of Dicrocoelium dendriticum larval stages in mollusc and ant intermediate hosts by PCR，using mitochondrial and ribosomal internal transcribed spacer（ITS-2）sequences［J］.Parasitology，2011，138（14）：1-8.

［9］马萍.小尾寒羊羔羊寄生虫病调查及防治效果［J］.中国兽医寄生虫病，2007，15（5）：35-37.

Infection and identification ofDicrocoelium dendriticumof sheep in Linxia，Gansu province

YUE Dong-mei1，2，WANG Jin-lei2，MA Jun2，HUANG Si-yang2，ZHU Xing-quan2，WANG Chun-ren1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China；2.State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province，Lanzhou Veterinary Research Institute，CAAS，Lanzhou 730046，China）

Dicroceliosis is one of the major parasitic diseases which seriously endanger the cattle and sheep.In order to investigate the natural infection of sheep in the area of Linxia Hui Autonomous Prefecture，Gansu province，and guide the prevention and control work effectively，the representative abattoir was selected.In this study，the pathogens were first detected by the morphological identification，and then they were isolated and identified by，PCR and DNA sequencing.The results indicated that all of the were Dicrocoelium dendriticum.

Dicrocoelium；Survey；Linxia Hui Autonomous Prefecture；isolation；identification

WANG Chun-ren

S852.73+5

A

0529-6005（2016）09-0013-02

2016-03-07

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2015CB-150300）

岳东梅（1989-），女，硕士生，从事动物寄生虫病研究，E-mail：dongmeiyue@163.com

王春仁，E-mail：chunrenwang@sohu.com