固定化半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究

刘鑫龙王立晖 汤卫华 潘志恒 程秀玮 孙勇民

（天津现代职业技术学院，天津300350）

固定化半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的研究

刘鑫龙*王立晖 汤卫华 潘志恒 程秀玮 孙勇民

（天津现代职业技术学院，天津300350）

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是一种具有天然属性的功能性低聚糖，是人体肠道中有益菌群极好的营养源和有效的增殖因子，对平衡肠道中的有益菌群，保障人体的发育及提高免疫力具有巨大的价值。同时，由于低聚牛乳糖不被人体胃酸、胃酶降解，难以被小肠吸收，又具有糖类的共有属性和较好的口感，因而被广泛用于制作高血脂、肥胖、糖尿病人的无热量食品，成为提供甜味的主要原料之一。此外，低聚半乳糖同蛋白质共热会发生美拉德反应，可以用于特殊性质的食品如面包、糕点等的加工，具有广阔的开发前景。

目前，低聚半乳糖的的合成主要有3种方式：天然高聚物的水解（酸法和酶法），糖苷酶的催化合成，化学合成法。化学合成法目前只在实验室研究中使用，不具有工业化前景。酸法降解高聚糖虽然可以获得较高产率的半乳糖，但因为副反应较多，使产物提纯工序的难度加大，应用受到了很大的限制。因此在低聚半乳糖工业化的生产中主要采用酶法合成，尤以微生物来源的β-半乳糖苷酶为主。尽管直接以β-半乳糖苷酶催化合成，反应条件温和，产率较高，但游离酶因为只能在水溶液中使用，稳定性差，不利于连续反应，回收困难，重复利用性差等原因，限制了其广泛应用，而将酶固定化是解决这些问题的有效方法之一。本课题组采用壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂固定化β-半乳糖苷酶，酶的活力回收率达70.5%。同时，固定化酶具有良好的储存和操作稳定性，在储存4周后，保持88.5%的酶活力；重复操作5次后，保持67.3%的酶活力，具有良好的应用前景。本文将在此基础上研究以β-半乳糖苷酶作为催化剂，催化合成低聚半乳糖过程中各反应因素对产物得率的影响，包括底物浓度、酶用量、温度、pH、离子添加剂等，筛选最优反应条件。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

β-半乳糖苷酶，来源于米曲霉，13.4 U/mg，Sigma公司；壳聚糖，脱乙酰度≥90%，深圳市中发源生物科技有限公司；乳糖，化学纯，天津市光复精细化工研究所；戊二醛，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

UV-5500（PC）紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；HNY2012C恒温摇床培养箱，上海百典仪器有限公司；HH-1数显恒温水浴锅，嘉兴市中新医疗仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1壳聚糖-戊二醛固定化酶的制备

用乙酸溶液配制体积浓度4%的壳聚糖（分子量为3×105）溶液，真空脱泡后逐滴滴入到4 mol/L的NaOH与甲醇的混合液（体积比为3∶1）中，过滤并用蒸馏水洗涤和磷酸缓冲液浸泡12 h，晾干得到壳聚糖微球。将其加入到戊二醛（10 g/L）中，常温振荡反应1 h后，过滤并用磷酸缓冲液洗涤。在4 ℃条件下，将洗涤后的壳聚糖微球加入到β-半乳糖苷酶溶液反应12 h。离心分离并用磷酸缓冲液洗涤沉淀，冷冻干燥后即可得到固定化的半乳糖苷酶。

1.2.2低聚半乳糖的合成

用pH7.5的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液配制一定浓度的乳糖溶液20 mL，置于50 mL 锥形瓶中，加入一定量的β-半乳糖苷酶酶液，置于一定温度的恒温水浴摇床中160 r/min反应一段时间。

1.2.3分析方法

取250 μL样品稀释40 倍，用孔径0.45 μm滤膜过滤后进液相色谱检测，并根据预先绘制的乳糖、葡萄糖、半乳糖（色谱纯）的标准曲线计算得到低聚半乳糖的得率。

检测条件： Aminex HPX-87H 色谱柱，流动相为浓度0.05 mol/L的H2SO4，流速0.6 mL/min，柱温65 ℃，示差检测器，进样量20 μL。

2　结果与讨论

2.1乳糖质量浓度的选择

底物乳糖质量浓度的高低不仅影响低聚半乳糖最终产量，而且对反应速率也有显著影响。分别以20 mL质量浓度为25%、35%、40%、45%、50%、55%的乳糖溶液为底物，在40 ℃、pH7.0 、酶量为240 g/L的条件下反应，乳糖质量浓度对GOS的产率的影响如图1所示。

图1　乳糖质量浓度对GOS产率的影响

由图1可知，在不同底物浓度下反应4 h后，GOS产率达到最大值。随着乳糖溶液质量浓度的增大，GOS的生成速率也在不断增加，反应4 h后达到反应平衡。其中底物浓度为50%时，GOS最大产率为49%。进一步增加底物浓度，产物产率没有明显变化。这个现象可以做出如下解释：①乳糖分子在β-半乳糖苷酶作用下生成半乳糖基，水和糖类分子均可作为半乳糖基的受体分别生成半乳糖和低聚半乳糖，两者作为受体的几率基本相同，而增加初始乳糖质量浓度从另一方面而言也降低了反应体系中水的含量，促进了GOS的合成；②乳糖质量浓度增大，可增加乳糖作为受体的几率，这是乳糖质量浓度影响GOS产率的主要原因。尽管乳糖价格低廉，但综合分析成本，选择质量浓度50%的乳糖为最佳底物浓度。

2.2酶用量的选择

以50%的乳糖为底物浓度，分别以120 g/L、240 g/L、480 g/L、640 g/L、800 g/L的酶溶液为催化剂，在40 ℃、pH7.0条件下反应，考察酶用量对GOS产率的影响，结果见图2。由图2可知，加酶量越大，乳糖的产率越高。当酶浓度为640 g/L时，最大产物产率为60.2%。进一步增加酶用量，并不会使产率发生明显变化。这是因为当加酶量较小时，酶催化能力不足，增加酶用量能使更多的底物分子接触到吸附的酶分子的活性中心，提高反应速率和产物产率。这种在大量酶用量条件出现产物产率趋于平衡的现象很有代表性，与以前的研究报道完全相符。鉴于酶制剂价格较高，选择640 g/L作为最适酶液浓度。

图2　酶用量对GOS产率的影响

2.3反应温度和反应pH的选择

以50%的乳糖为底物浓度，640 g/L为酶液浓度，先后改变反应体系的pH和温度，从而测定其对GOS产率的影响，结果如图3和图4所示。结果表明，固定化β-半乳糖苷酶的转糖苷活性和水解活性的最适温度均为40 ℃，最适反应pH为6.5，且温度、pH 变化对酶活影响显著，是影响β-半乳糖苷酶酶活的主要因素。这主要是因为壳聚糖载体表面的润湿性促使酶分子表面电荷发生改变，促使弱碱性酶最适pH变为偏酸性。此外，反应温度对于低聚半乳糖得率也有影响，通常提高温度能够促进低聚半乳糖的合成，但温度如果太高也增加了酶失活的可能性，导致GOS产率降低。

图3　pH对GOS产率的影响

图4　温度对GOS产率的影响

2.5离子添加剂的选择

金属离子能够通过可以激活或抑制酶的活性位点影响酶的催化性能，不同金属离子对固定化半乳糖苷酶的活性存在影响。试验结果表明，浓度为2 mmol/L时，Mg2+的存在使低聚半乳糖的产率提高了10%以上，达到70.5%；其他金属离子因为会破坏酶蛋白的构象导致酶失活，促使GOS产率降低。这对于提高生产效率和设备利用率都具有重要的现实意义。

2.6催化剂的重复利用性

在最优条件下，测定固定化半乳糖苷酶的重复使用稳定性。将反应后的固定化酶用pH6.5的缓冲溶液冲洗干净后，作为催化剂重复下一轮试验，结果如图5所示。在重复使用第2次时出现GOS产率最大值（73%），原因可能是经过浸泡，壳聚糖的通透性和表面润湿性得到提高，底物乳糖更容易透过与乳糖酶接触，同时酶分子的活性中心得到激活展开，从而提高了反应速率。在固定化酶重复使用7次后，产物产率下降为64.9%，展现了良好的稳定性。

图5　固定化酶的重复使用性

3　总结

随着社会对功能性食品、保健食品要求的不断提高，低聚半乳糖的重要性也逐渐得到更多的人重视。本文研究了以壳聚糖吸附与戊二醛交联固定化的半乳糖苷酶为催化剂合成低聚半乳糖的过程，并对反应条件进行了单因素优化。试验结果表明，固定化半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最佳反应条件为：以质量浓度50%的乳糖为底物，溶液pH 值为6.5，反应温度为40 ℃，体系中加入2 mmol/L的Mg2+，640 g/L的酶用量，反应4 h后，低聚半乳糖的产率为71.5%。在重复使用7次后，催化得到的GOS产率为64.9%，展现了良好的稳定性。

［1］张晓萍，段钢. 功能性低聚糖酶法制备研究进展［J］. 2011，37（4）：159-165.

［2］汤卫华，王立晖，殷海松，等. 壳聚糖微球固定化B-半乳糖苷酶［J］. 食品与发酵工业，2015（5）：105-109.

［3］RAMACHANDRAN SIVARAMAKRISHNAN，MUTHUK UMAR K. Production of methyl ester from oedogonium sp. oil using immobilized isolated novel Bacillus sp. lipase［J］. Energy & Fuels，2012，26（10）：6 387-6 392.

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［5］邢肖肖，齐崴，王梦凡，等. 半乳糖苷酶酶学性质及其在低聚半乳糖合成中的应用［J］.生产加工过程，2015，13（2）： 31-34.

Study on immobilized galactosidase enzymatic synthesis of galactooligosaccharides

LIU Xinlong*WANG Lihui TANG Weihua PAN Zhiheng CHENG Xiuwei SUN Yongmin
（Tianjin modern vocational and technical college，Tianjin 300350，China）

随着社会对功能性食品、保健食品要求的不断提高，低聚半乳糖的重要性也逐渐得到更多人的重视。研究了以壳聚糖吸附与戊二醛交联固定化的半乳糖苷酶为催化剂合成低聚半乳糖的过程，并对反应条件进行了单因素优化。试验结果表明，最佳反应条件为：质量浓度50%的乳糖为底物，溶液pH 值6.5，反应温度40 ℃，体系中加入2 mmol/L的Mg2+，640 g/L的酶用量，反应4 h后，低聚半乳糖的产率为71.5%。在重复使用7次后，催化得到的GOS产率仍为64.9%，展现了良好的稳定性。

β-半乳糖苷酶；壳聚糖；交联法；低聚半乳糖

As society continues to raise the requirements for functional foods，the importance of galactooligosaccharides gradually get more people's attention. Study on the adsorption chitosan and glutaraldehyde cross-linked immobilized galactosidase synthesis catalyst for the oligomerization process galactose，and the reaction conditions were optimized. The test results showed that the optimum reaction conditions were： mass concentration of 50% lactose as a substrate，the pH value of 6.5，the reaction temperature of 40 ℃，the system was added 2 mmol/L of Mg2+，the enzyme dosage of 640 g/L，the reaction after 4 h ，galactooligosaccharides yield of 71.5%. After repeated 7 times，GOS producing catalytic obtained was still 64.9%，showing good stability.

β-galactosidase；chitosan；crosslinking；galactooligosaccharide

TS245.5

A

1673-6044（2016）01-0020-03

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.01.007

* 刘鑫龙，男，1988年出生，2014年毕业于河北工业大学生物工程专业，助教。

2015-12-22