脑胶质瘤中SPOPL表达及其临床意义☆

徐彬张弩胡远军杨毅兵严圣刘金龙夏之柏

脑胶质瘤中SPOPL表达及其临床意义☆

徐彬*张弩*胡远军*杨毅兵*严圣*刘金龙*夏之柏*

目的探究SPOPL蛋白（speckle-type POZ protein-like）在胶质瘤组织中的表达及其临床意义。方法收集68例胶质瘤患者病例标本及瘤旁正常脑组织，其中低级别胶质瘤32例（WHOⅠ-Ⅱ），高级别胶质瘤36例（WHOⅢ-Ⅳ），用免疫组织化学法、蛋白质印迹法检测SPOPL蛋白表达，并分析临床指标与SPOPL表达量之间的关系。结果胶质瘤组织中SPOPL的表达低于瘤周组织（t=8.754，P＜0.05），高级别胶质瘤中SPOPL的表达低于低级别胶质瘤（t=13.552，P＜0.05）；SPOPL的表达与病理级别有关（χ2=4.023，P＜0.05）；Cox回归模型提示肿瘤病理级别、SPOPL蛋白表达差异是胶质瘤患者预后的独立危险因素。结论 SPOPL蛋白的表达与胶质瘤病理级别及患者预后呈负相关，其可能是反应胶质瘤生物学特征及患者预后的的一个新的分子标记物。

胶质瘤 SPOPL病理级别 分子标记物

脑胶质瘤是颅内恶性肿瘤，约占中枢神经系统肿瘤的1/2［1］。目前，胶质瘤的治疗仍以手术切除后辅助放化疗为主，但总体质量效果仍不理想。SPOP（Speckle-type POZ protein）作为一种重要的E3泛素化连接酶，在多种实体肿瘤中均发现其表达下降，如前列腺癌、胶质瘤、胃癌等，并进一步证实其具有抑癌基因功能［2-4］。而SPOPL（Speckle-type POZ protein-like）作为SPOP（Speckle-type POZ protein）的同源基因，二者序列同源性达82.6%，且2个高同源性的蛋白可相互作用，其机制由SPOPL以比率及剂量依赖的方式抑制SPOP自我装配和E3泛素连接酶活性来实现。同源的SPOPL蛋白在各种肿瘤中的表达情况尚不清楚［5］。本研究通过检测SPOPL在原发恶性胶质瘤及瘤旁正常脑组织中的表达水平，分析其在胶质瘤中的临床意义。

1　材料与方法

1.1一般资料收集2001年1月至2006年12月中山大学附属第一医院神经外科68例胶质瘤患者的胶质瘤组织及瘤周组织的石蜡标本。病例纳入标准：①患者均为原发胶质瘤且第一次行胶质瘤全切术；②术后行规范化放疗加替莫唑胺化疗；③患者无其他恶性肿瘤、全身系统性疾病及免疫性疾病。排除标准：①患者术后复发，再次手术；②非正常死亡患者。其中男43例，女25例。按WHO病理分级标准，经病理证实，其中Ⅰ级14例，Ⅱ级18例，Ⅲ级19例，Ⅳ级17例。对所有纳入研究的患者进行为期60个月的随访，均未有失访，以患者死亡作为终点事件，其中低病理级别（WHOⅠ-Ⅱ）28例，高病理级别（WHOⅢ-Ⅳ）36例发生终点事件。所有研究事项获患者及家属同意。试剂与仪器：免疫组化BCA试剂盒（日本同仁公司），兔抗人SPOPL多克隆抗体（Abcam公司），鼠抗人beta-actin单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnolohgy公司）。其他试剂及仪器均由中山大学北校区科技楼张弩教授实验室提供。

1.2SPOPL免疫组化检测 标本经10%甲醛固定，石蜡包埋、切片、脱蜡、水化，PBS冲洗3遍，3% H2O2阻断，PBS再次冲洗3遍，抗原修复，血清封闭，加一抗（1：500），4℃过夜，PBS冲洗3遍，滴加二抗，37℃孵育20min，DAB显色3 min，苏木素复染、脱水，透明、封片。通过阳性细胞染色率与染色强度评估SPOPL蛋白表达量。根据阳性细胞染色率评分：0（＜5%，阴性），1（5%～25%，弱阳性），2（＞25%～50%，阳性），3（＞50%，强阳性）。根据染色强度评分：0（未染色），1（淡黄色），2（棕黄色），3（棕褐色）。以两者评分相乘作为最终评分，为0～9分。病理样本分为：＜4分为低表达，≥4分为高表达。

1.3SPOPL蛋白质印迹检测 标本漂洗后液氮碾至粉末，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。8% SDS-PAGE胶电泳分离含25μg蛋白样品，将分离后的蛋白转移到PVDF膜，脱脂奶粉室温封闭1h，加一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3遍，加二抗，室温孵育1h，再次TBST洗膜3遍，显色。

1.4统计学方法 数据分析由SPSS 19.0完成。计量资料用x±s表示，肿瘤组织与瘤周组织，低病理级别与高病理级别组织中SPOPL的表达采用两独立样本t检验；SPOPL的表达与临床病理参数的关系采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法并建立Cox回归模型分析SPOPL的不同表达对患者预后的影响，检验水准均为α=0.05。

2　结果

2.1SPOPL在脑组织中的表达水平免疫组织化学染色法显示SPOPL可表达在脑组织胞浆、胞核中，呈棕黄色或棕褐色染色，间质组织无染色，见图1。得出标本中的SPOPL灰度值与对照β-actin条带灰度值比值，作为SPOPL蛋白表达水平，见图2，在瘤周组织中为5.26±0.34，低病理级别中为2.21±0.28，高病理级别中为0.38±0.16，瘤周组织与胶质瘤组织（t=8.754，P＜0.05），低病理级别与高病理级别（t=13.552，P＜0.05），差异有统计学意义，见表1。

2.2SPOPL的表达与临床病理特征的关系 经对患者年龄、性别、WHO病理分级与SPOPL蛋白表达量进行统计分析，结果显示：SPOPL的表达与病理级别有关（P＜0.05），与患者年龄，性别无关（P＞0.05），见表2。

2.3SPOPL的表达与预后的关系通过Kaplan-Meier法制作生存曲线，见图3，可知SPOPL的不同表达对患者的预后有不同影响（Log-Rank= 52.304，P＜0.05），低表达组1年生存率为68.6%（24/35），3年生存率为2.85%（1/35），高表达组1年生存率为97.0%（32/33），3年生存率为69.7%（23/ 39）。Cox回归模型中显示，胶质瘤患者的预后与年龄、性别无关（P＞0.05），与病理级别、SPOPL蛋白均有关系（P＜0.05），见表3。

3　讨论

胶质瘤的发生发展是多因素作用多阶段演变的过程［6，7］，也是癌基因和抑癌基因等基因异常的累积结果，既涉及抑癌基因的突变、失活如P53，P16，PTEN等又与原癌基因激活如VEGF，EGFR， PDGF等密切相关，从而导致细胞周期调控失常，细胞信号传导通路异常，细胞凋亡缺陷和细胞生命周期延长，甚至永生化［8］。

图1　胶质瘤组织和瘤周组织中SPOPL的表达（SP，×200）。A：瘤周组织中SPOPL的强阳性染色；B：胶质瘤组织中SPOPL的阳性染色；C：低病理级别胶质瘤组织中SPOPL的高表达；D：高病理级别胶质瘤组织SPOPL的低表达

图2　蛋白印迹法检测脑组织中SPOPL蛋白的表达水平。1：瘤周组织；2：胶质瘤组织；3：低级别胶质瘤组织；4：高级别胶质瘤组织；β-actin作为对照

图3　SPOPL蛋白不同的表达对胶质瘤预后的影响

表1　SPOPL在肿瘤组织和瘤周组织中的表达

表2　SPOPL的表达与临床特征的关系

表3　影响胶质瘤患者预后因素的Cox模型分析

泛素化是指泛素（真核生物中普遍存在的一种蛋白，它在各物种间差异小，保守性高）分子在一系列特殊的酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程，过程中涉及到三种酶（泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3）。E3泛素化连接酶复合体在泛素化过程中决定底物的特异性。泛素化参与蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解，并起着十分重要的作用。同时，它也参与了细胞增殖、凋亡、周期、分化、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。因此整个泛素化的过程中，若出现异常，上述生命活动的调控受影响就不难想象。Cullin-RING（CRL）家族是哺乳动物中最大的泛素连接酶家族，SPOP蛋白是MATH-BTB蛋白家族中的一员，是一个CRL衔接蛋白，与Cul3链接形成复合体。SPOP维持正常细胞的生长和发育，而在不同的人类的肿瘤中都出现了SPOP基因低表达或者拷贝的下降。其中作为泛素化连接酶的SPOP蛋白已有报道，在多种实体肿瘤均发现SPOP表达下降，如前列腺癌，胶质瘤等，并进一步证实其具有抑癌基因功能［2，3，9］。

有文章报道一个尚未明确特征的SPOP同源体，被命名为SPOPL（SPOP-Like，GenBank检索号：NM_001134447），在人类，大鼠和小鼠基因组中都存在（UniGene代码分别为 Hs.333297，Rn.198620，Mm.480695），且3个物种SPOPL蛋白高度保守，同源序列达96.2%～98.5%，且在人类组织中广泛表达，提示其可能涉及生物体某些基本功能。SPOPL作为SPOP的同源基因，二者的序列同源性达82.6%，而且2个高同源性的蛋白可以相互作用，其机制乃由SPOPL以比率及剂量依赖的方式抑制SPOP自我装配和E3泛素连接酶活性来实现［5，10］。综合上述，SPOPL和SPOP可能既存在功能相似性也具有竞争性作用，更值得注意的是，SPOPL组织表达谱广，而SPOP主要在小脑浦肯野纤维细胞和睾丸精小管细胞中高表达，其他组织表达水平低或者不表达，表明SPOPL更可能有其自身功能独立性和复杂性，有待更深入的探讨。

本研究发现，胶质瘤中SPOPL的表达水平与病理级别的关系，胶质瘤中SPOPL的表达低于瘤周组织，高级别肿瘤中SPOPL的表达低于低级别肿瘤，SPOPL的表达与胶质瘤患者的预后呈负相关性。

综上所述，SPOPL对胶质瘤的发生发展具有一定的影响，可能是一个反应胶质瘤恶性程度和预后的一个新的分子靶点。

［1］PAW I，CARPENTER RC，WATABE K，et al.Mechanisms regulating glioma invasion［J］.Cancer Lett，2015，362（1）：1-7.

［2］DING D，SONG T，JUN W，et al.Decreased expression of the SPOP gene is associated with poor prognosis in glioma［J］.Int J Oncol，2015，46（1）：333-341.

［3］LI G，CI W，KARMAKAR S，et al.SPOP promotes tumorigenesis by acting as a key regulatory hub in kidney cancer［J］.Cancer Cell，2014，25（4）：455-468.

［4］GAO K，JIN X.Tumor suppressor SPOP mediates the proteasomal degradation of progesterone receptors（PRs）in breast cancer cells［J］.Am J Cancer Res，2015，5（10）：3210-20

［5］CHOO KB，CHUANG TJ，LIN WY，et al.Evolutionary expansion of SPOP and associated TD/POZ gene family：impact of evolutionary route on gene expression pattern［J］.Gene，2010，460（1-2）：39-47.

［6］朱汝森，许成杰，兰柳波，等.脑胶质瘤细胞体外促进人骨髓间充质干细胞肿瘤相关基因表达［J］.中国神经精神疾病杂志，2016，42（1）：50-55.

［7］朱潇鹏，唐军海，黄国浩，等.IDH1突变和MGMT基因启动子甲基化在脑胶质瘤中表达及关联度分析［J］.中国神经精神疾病杂志，2015，41（2）：111-114.

［8］DIETEL M，JÖHRENS K，LAFFERT MV，et al.A 2015 update on predictive molecular pathology and its role in targeted cancer therapy：a review focussing on clinical relevance［J］.Cancer Gene Ther，2015，22（9）：417-430.

［9］HOELLER D，DIKIC I.Targeting the ubiquitin system in cancer therapy［J］.Nature，2009，458（）：438-444.

［10］ERRINGTON WJ，KHAN MQ，BUELER SA，et al.Adaptor protein self-assembly drives the control of a cullin-RING ubiquitin ligase［J］.Structure，2012，20（7）：1141-1153.

（责任编辑：甘章平）

The Expression of Speckle-type POZ protein-like（SPOPL）in Brain Glioma.

XU Bin，ZHANG NU，HU Yuanjun，YANG Yibing，YAN Sheng，LIU Jinlong，XIA Zhibo.Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of SUN Yat-sen University，58 Zhongshan RoadⅡ，Guangzhou 510080，China.Tel：020-87755766.

Objective To explore the expression of Speckle-type POZ protein-like（SPOPL）in human glioma tissues and its relationship with clinical pathological parameters and prognosis.Methods Immunohistochemical and western blotting method were used to detect SPOPL expression in glioma tissues and tumor peripheral tissues in 68 cases of glioma patients including 32 cases of low grade gliomas（WHO I-II），and 36 cases of high grade gliomas（WHO IIIIV）.T test，χ2test，Kaplan-Meier method and the Cox regression model were used to analyze the relationship between the expression and clinical indicators.Results The expression of SPOPL was significantly lower in gliomas than in tumor peripheral tissues（t=-8.754，P＜0.05），the expression of SPOPL was lower in high pathological grade tissues than in low grade of glioma tissues（t=-13.552，P＜0.05）.SPOPL expression was associated with pathological grade（χ2=4.023，P＜0.05）.Cox regression model showed that the tumor pathological grade and different SPOPL protein expression were independent risk factors for the prognosis of patients with glioma.Conclusions SPOPL may be a biomarkers of human brain gliomas and can help to evaluate the prognosis of brain glioma.

Glioma SPOPL Clinical pathological characteristics Biomarker

R739.41

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.08.005

☆广州市科技计划项目产学研协同创新重大专项（编号：2016-0402004）资助

*中山大学附属第一医院神经外科（广州 510089）

（E-mail：2339186268@qq.com）

（2016-06-20）