酸枣仁皂苷A对果蝇睡眠影响的量效关系与时效关系研究

刘晓岩，刘美玉，卞宏生，李廷利

(黑龙江中医药大学中药药理教研室，哈尔滨 150040)



酸枣仁皂苷A对果蝇睡眠影响的量效关系与时效关系研究

刘晓岩，刘美玉，卞宏生，李廷利*

(黑龙江中医药大学中药药理教研室，哈尔滨 150040)

目的研究酸枣仁皂苷A对野生型CS品系果蝇睡眠作用影响的量效关系与时效关系。方法选择野生型CS品系7 d龄雄性果蝇为研究对象,采用液体给药的方式，利用果蝇活动监测系统，观察不同浓度酸枣仁皂苷A对果蝇睡眠影响的量效关系和时效关系。结果1 mg/mL剂量为最佳给药浓度，给药3 d为最佳给药时间，并可以明显延长果蝇白天平均睡眠的总时间和夜晚平均睡眠的总时间，增强果蝇的片段化睡眠。结论酸枣仁皂苷A对野生型CS品系7 d龄雄果蝇的睡眠具有一定的改善作用。

酸枣仁皂苷A；果蝇；睡眠

酸枣仁是鼠李科枣属植物酸枣的干燥成熟种子[1],具有补肝、宁心、敛汗、生津的功效。主治虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴等症。酸枣仁的化学成分比较多[2-4]，目前已从酸枣仁中分离得到达玛烷型三萜皂苷、三萜类化合物、黄酮类化合物、生物碱、脂肪油和各种维生素等活性化学成分，并有研究确定酸枣仁皂苷元有镇静催眠作用，酸枣仁皂苷A是酸枣仁中含量较高的有效成分之一。目前对此单体物质的药理、毒理、构效关系、量效关系、谱效关系及临床的研究还很少。

1　材料

1.1实验动物野生型Canton S品系黑腹果蝇(Drosophila melnogaster)(由北京大学生命科学学院提供) 饲养于自动定时光控系统。实行每天12 h∶12 h的明暗光照周期处理，温度(24±1)℃，相对湿度50%～60%，光照强度为400 lux[5-6]。

1.2药物与试剂酸枣仁皂苷A，外观为白色结晶粉末，HPLC≥98.60%，批号：MUST-15020411(成都曼思特生物科技有限公司中国科学院成都生物研究所)。蔗糖(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20140111)；琼脂(细菌学级，产地日本，批号：201501)；酵母粉(食品级，安琪酵母股份有限公司，批号：20150512)；玉米粉(食品级)。

1.3实验仪器果蝇雌雄分离装置(自制)果蝇活动监测系统(DAMS，USA.)；二氧化碳麻醉装置(自制)；镊子、毛笔、果蝇培养指管、脱脂棉。

2　方法

2.1培养基的配制

2.1.1果蝇基础培养基的配制(用于果蝇的饲养)[7-8]准确量取蔗糖(31 g)、琼脂(3 g)和蒸馏水(300 mL)，三者充分混匀搅拌，加热煮沸至琼脂完全熔化，形成A液体；准确量取玉米粉(42 g)与蒸馏水(160 mL)，两者充分混匀搅拌，形成B液体；将A液体和B液体充分混匀，并不断搅拌，煮沸至糊状，停止加热；待A、B糊状混合液温度降至60～70 ℃，加入酵母粉(3 g)，充分搅拌后，加入丙酸(3 mL)，搅拌均匀，立即分装于洁净的培养指管中，每管培养基厚度为1.5～2 cm，待培养基完全凝固后，将培养管倒置于操作室内，待完全冷却凝固后即可使用。

2.1.2果蝇液体培养基配制(用于空白组)[9]准确量取2.5 g的蔗糖，置于50 mL烧杯内，加入50 mL的蒸馏水，不断搅拌使其溶解均匀。用移液管移入10 mL容量瓶中定容，充分摇匀后备用(用于实验空白组)。

2.1.3果蝇含药培养基配制(用于给药组)[10-12]首先配制5%的蔗糖溶液待用，准确量取酸枣仁皂苷A 2.5、5、10、20、40 mg，分别置于50 mL烧杯内，分别加入10 mL的5%的蔗糖溶液，移入10 mL容量瓶中定容，配制成不同剂量的溶液，分别为0.25、0.5、1、2、4 mg/mL，摇匀混合后备用。

2.2量效关系研究方法选择7 d龄雄性果蝇为研究对象，收集12 h内刚羽化未交配的雄性果蝇，饲养6 d后，分为空白组和不同剂量给药组，每组32只，将果蝇移入监测管中，适应6 h，启动DAMS，记录早7∶00到次日早7∶00果蝇24 h睡眠活动时间。

2.3时效关系研究方法选择7 d龄雄性果蝇为研究对象，收集12 h内刚羽化未交配的雄性果蝇，饲养6 d后，给予量效关系实验中最佳剂量，按照不同给药天数分组，每组32只，将果蝇移入监测管中，适应6 h，启动DAMS，记录早7∶00到次日早7∶00果蝇24 h睡眠活动时间。

2.4统计学处理通过EXCEL软件对实验数据进行处理。采用SPSS 17.0统计软件，2组以上比较时采用单因素方差分析方法进行数据处理，用LSD法进行两两比较；2组间比较时采用独立样本t检验法。P<0.05为有统计学意义。

3　结果

3.1酸枣仁皂苷A对果蝇镇静催眠作用的量效关系见表1。

表1　酸枣仁皂苷A对雄果蝇睡眠影响的量效关系±s)

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01

3.2酸枣仁皂苷A对果蝇镇静催眠作用的时效关系见表2。

实验结果表明，给药2 d后，果蝇的全体平均睡眠时间延长，白天睡眠时间没有显著性差异，而夜晚睡眠时间有显著性差异。给药3 d后，果蝇的白天和夜晚平均睡眠时间均明显延长，均有极显著性差异，P<0.01。给药4 d后，果蝇的睡眠时间均缩短。故确定最佳的给药天数为3 d。

表2　酸枣仁皂苷A对雄果蝇睡眠影响的时效关系±s)

注：与空白组比较，#P<0.05,##P<0.01

4　小结

通过果蝇的预实验的前期工作,选择了7 d龄果蝇作为观察对象，并设计了5个酸枣仁皂苷A的给药浓度，以监测管内液体给药的方式进行酸枣仁皂苷A对果蝇睡眠影响作用的量效关系研究，摆脱了培养基给药定量不准确的困扰，探索酸枣仁皂苷A对果蝇睡眠影响的最佳给药剂量。并能通过睡眠觉醒的节律图得到酸枣仁皂苷A对果蝇白天和夜晚睡眠片段化睡眠增强的影响[13-14],睡眠是一个复杂的生理过程[15]，前期研究证实，果蝇也有类似哺乳动物的睡眠样状态[16-17]，而果蝇一直都是基因研究领域最重要的模式生物之一，有着繁殖快，易于操作，基因明确的优势，为后续利用分子生物学知识探求睡眠的机制提供了研究基础。

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Dose-effect and time-effect of Jujuboside A in drosophila sleep

LIU Xiaoyan,LIU Meiyu,BIAN Hongsheng,LI Tingli*

(Traditional Chinese Medicine Pharmacology Teaching and Research Section,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

ObjectiveTo study the dose-effect and time-effect of Jujuboside A in drosophila sleep.MethodsThe 7-day-old male drosophila as the research object,with the method of liquid dosage,using drosophila activity monitoring system,observe the different concentration of Jujuboside A in drosophila a sleep affects the dose-effect and time-effect.ResultsThe dose of 1 mg/mL the best drug concentration,3 days as the best delivery time,and can obviously prolong drosophila,on average,the total time of sleep during the day and night,on average,the total time of sleep.Enhance the drosophila with fragmented sleep.ConclusionJujuboside A can improve the 7-day-old male drosophilas sleep time

Juiuboside A;drosophila;sleep

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.009

黑龙江中医药大学“优秀创新人才支持计划”基金资助项目(2012RCL03)。

刘晓岩(1985-)，女，博士，讲师，主要从事天然药物生物活性与方法作用机理研究。

李廷利，博士，教授，电话-13804527211，电子信箱-ltlhlj@126.com

R285.5

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2095-6258(2016)05-0905-03

2015-12-08)