红树莓原液对D-半乳糖模型小鼠抗衰老作用

李书丹，宋　娜，李晓东，于晓红

(1.齐齐哈尔中医院，黑龙江 齐齐哈尔 161000；2.哈尔滨市儿童医院，哈尔滨 150010;3.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)



红树莓原液对D-半乳糖模型小鼠抗衰老作用

李书丹1，宋娜2，李晓东1，于晓红3*

(1.齐齐哈尔中医院，黑龙江 齐齐哈尔 161000；2.哈尔滨市儿童医院，哈尔滨 150010;3.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

目的从抗氧化及免疫调节机制探讨红树莓原液对D-半乳糖模型小鼠抗衰老作用。方法观察测定红树莓原液对D-半乳糖模型小鼠的治疗作用；应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清IL-2、IL-10水平，取小鼠肝脏测其丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)。结果红树莓原液可上调D-半乳糖模型小鼠IL-2的表达，下调IL-10的表达水平，可以提高GSH-Px水平，降低MDA水平。结论红树莓原液可以通过调节D-半乳糖模型小鼠的免疫状态，从而起到抗衰老的作用。

红树莓原液；IL-2；IL-10；丙二醛；谷胱甘肽过氧化物酶

红树莓为半灌木性聚合浆果植物，富含多种维生素和矿质元素，尤其富含SOD，鞣质酸等抗癌、抗疲劳物质，美国人称之为“生命之果”，是中药覆盆子家族的一员，俗称“托盘”“刺莓”等[1]。药典记载:覆盆子甘、酸、温；归肝、肾、膀胱经；有益肾固精缩尿，养肝明目之效。民间红树莓也被广泛食用，其果实柔嫩多汁，酸甜可口，具有止渴、活血及抗肿瘤等功效，已被人们作为良好的防病保健水果。遂选用D-半乳糖模型小鼠作为研究对象，研究探讨其抗衰老作用。本实验从基因角度,通过观察红树莓原液对D-半乳糖模型小鼠的IL-2、IL-10表达的影响及对D-半乳糖模型小鼠MDA、GSH-PX的影响来进一步探讨红树莓抗氧化的机制及其免疫调节的机制，以期获得红树莓抗氧化、免疫调节作用的全面认识，为红树莓的临床应用提供理论依据和全面可靠的现代医学研究的基础资料[2]。

1　材料

1.1动物及分组选用健康昆明系小鼠60只(购于黑龙江中医药大学动物实验中心，许可证号:黑医实验动物单项准第61号。)雌雄各半，体质量(18±2.0)g，采用随机数字表法将小鼠随机分为空白组、模型组、维生素E组、红树莓原液低剂量组(10 g/kg)、红树莓原液中剂量组(20 g/kg)、红树莓原液高剂量组(40 g/kg)，共6组，每组10只。

1.2药物红树莓原液： 红树莓采摘于黑龙江省尚志市帽儿山，鲜果洗净、自然干燥、捣碎(不添加蒸馏水)、抽滤去滓，获得浓度为1.1 g/mL红树莓原液。临用时倍比稀释成不同浓度的红树莓原液。环磷酰胺注射液 ：购于江苏恒瑞医药股份有限公司(批号：H32026196)。甘露聚糖肽： 购于贵州神奇制药有限公司(批号：H52020862)。

1.3试剂小鼠IL-2、IL-10检测试剂盒购于美国R&D公司，丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒购于南京建成科技有限公司，D-半乳糖、维生素E、蒸馏水、生理盐水等均购于哈尔滨博润生物科技公司。

2　方法

2.1动物模型的制备本实验采用D-半乳糖亚急性人工衰老模型，即小鼠颈部皮下注射D-半乳糖剂量1 mg/(10 g·d),连续6周。观察小鼠状态，小鼠出现毛色灰暗、失去光泽、形态瘦弱、行动缓慢、精神萎靡不振、体质量下降，呈现明显衰老体征，证明D-半乳糖衰老模型建立成功。2.2给药方法及剂量空白组：蒸馏水灌胃0.18 mL/(10 g·d)，颈背部皮下注射生理盐水0.1 mL/(10 g·d)。模型组：蒸馏水灌胃0.18 mL/(10 g·d)，颈背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。维生素E组：维生素E灌胃0.5 mg/(10 g·d)，颈背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。低剂量组：红树莓灌胃0.1 g/(10 g·d)，颈背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。中剂量组：红树莓灌胃0.2 g/(10 g·d)，颈背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。高剂量组：红树莓灌胃0.4 g/(10 g·d)，颈背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。

2.3 标本采集及检测

2.3.1肝脏称重小鼠自由进食3 d，适应环境。第3天称重，按以上剂量给药。1次/d，连续6周。自给药第1天起，每7 d称重调整给药剂量。末次给药后，禁食12 h，称重，摘眼球取血，颈椎脱臼处死，以75%乙醇浸泡消毒后取肝脏。

2.3.2小鼠血清中IL-2和IL-10含量的测定具体步骤按照所购试剂盒说明书操作，分离各组小鼠血清，应用ELISA方法检测各组血清中IL-2和IL-10。

2.3.3小鼠肝脏中MDA和GSH-Px的测定取经75%乙醇浸泡消毒后的肝脏，加入生理盐水，用玻璃匀浆器充分研磨使组织浆化，制成10%匀浆。3 000 r/min离心10～15 min，取上清液。然后按照MDA和GSH-Px试剂盒说明书操作。

3　结果

3.1红树莓原液对D-半乳糖模型小鼠IL-2和IL-10的影响见表1。

组　别IL⁃2IL⁃10空白组5．75±1．67　　3．94±1．19　　模型组3．04±0．88　　6．86±1．58　　维生素E组4．99±1．88##4．64±1．76##低剂量组4．48±2．30#　4．45±1．60##中剂量组4．54±1．66#　4．31±1．13##高剂量组4．21±1．92　　4．45±1．60##

注：与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

3.2红树莓原液对D-半乳糖模型小鼠GSH-Px、MDA的影响见表2。

组　别GSH⁃PXMDA空白组349．04±61．17　　0．76±0．160　　模型组221．12±54．91　　1．16±0．250　　维生素E组323．49±80．14##0．80±0．160##低剂量组296．14±118．65#　0．92±0．260#　中剂量组322．40±87．16#　0．85±0．240##高剂量组290．89±59．38##0．90±0．280#　

注：与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

4　讨论

红树莓原液主要是对免疫器官的影响和对体液及细胞免疫调节，从而起到抗衰老作用[3]，提高人体免疫功能延缓人体的衰老过程。T淋巴细胞在免疫调节方面起一定主导作用,根据CD4+T细胞所产生的细胞因子种类及介导功能不同，可将其分为Th1、Th2和Tr细胞，Th1型细胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12及TNF-β/α等Th1型细胞因子,主要参与细胞免疫；Th2型细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等Th2型细胞因子,起到辅助体液免疫应答作用；机体免疫功能正常状态下Th1、Th2型细胞及其分泌的细胞因子在数量上维持一种相对平衡状态，共同参与协调、促进机体免疫功能的发挥,这种生理平衡状态的打破,即Th1/Th2漂移，将引发各种疾病。IL-2是重要免疫增强因子，主要由活化的Th1细胞产生[4-7]。具有促进T细胞增殖、诱导LAK细胞、促进B细胞分泌抗体、促进T细胞杀伤作用及增强NKC活性等作用，主要参与机体的免疫调节。IL-10可通过多种途径参与免疫抑制，IL-10能减少如NO、自由基和前列腺素等炎性调节因子的分泌。实验研究表明，用D-半乳糖造模之后，这个平衡被打破，出现了Th1/Th2失衡，而红树莓不同剂量组给药后，小鼠的血清中不同程度的升高了IL-2水平，并可下调IL-10水平，从而形成一种自身的正反馈调节，使机体接近正常水平，改善机体的免疫状态，延缓免疫器官机能的衰退，从而提高机体对外界病原体的抵抗能力来抗衰老[8-12]。

MDA是脂质过氧化的主要产物之一，可间接反映机体受自由基攻击的严重程度，其不仅反映评价衰老的重要指标，更重要的是可以反映组织氧化的程度和细胞损失的程度。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的抗氧化酶，可以特异性催化还原GSH对过氧化氢的还原反应，直接反应机体氧化程度的生化指标[13-15]。实验研究发现造模之后，机体抗氧化酶活性降低及抗氧化剂减少，使机体总抗氧化能力下降，从而防御自由基能力降低，GSH-Px、MDA的浓度的变化直接证实D-半乳糖模型小鼠造模成功，增加机体对过氧化氢的还原能力，降低机体MDA浓度，降低组织和细胞的氧化水平，机体抗氧化酶活性提高，清除自由基的能力增强，使抗衰老能力也得到增强，用药组接近正常小鼠氧化水平[16-18]。

上述实验说明，红树莓原液可以改善机体免疫状态，提高免疫器官的机能，增强对外界病原体的抵抗能力，起到抗衰老作用。同时红树莓原液可以降低机体的氧化水平，提高机体抗氧化能力有效的起到抗衰老作用。本实验为红树莓的分离、提纯有效成分，研究开发其医药保健作用等后续研究提供了基础依据。

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Red raspberry on aging mice induced by D-galactose

LI Shudan1,SONG Na2,LI Xiaodong1,YU Xiaohong3*

(1.Qiqihaer Hospital of Traditional Chinese Medicine,Qiqihaer 161000,Heilongjiang Province,China;2.Children's Hospital of Harbin,Harbin 150010,China;3.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

ObjectiveTo research the antioxidant and immunomodulatory effects of red raspberry on aging mice induced by D-galactose.MethodsTreatment of red raspberry on D-galactose in mice,the serum levels of IL-2 and IL-10 were assayed with ELISA,and the levels of MDA and GSH-PX of livers were examined.ResultsRed raspberry significantly up-regulated the expression of IL-2 and dow-regulated the espression of IL-10.Red Raspberry obviously increased the level GSH-PX and lower the level of MDA.ConclusionRed raspberry is able to adjust the immune status of the D-galactose model mice.So as to play the role of antiaging.

Red raspberries;IL-2;IL-10;MDA;GSH-PX

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.008

李书丹(1982-)，女，硕士研究生，主管检验师，主要从事免疫方面的研究。

于晓红，女，教授，硕士研究生导师，电子信箱-hljyxh@sina.com

R285.5

A

2095-6258(2016)05-0902-03

2016-05-24)