益肾排毒方对腺嘌呤所致慢性肾衰竭大鼠肾功能的影响

周　微，杨秀炜

(辽宁省中医药研究院 辽宁中医药大学附属第二医院，沈阳110034)



益肾排毒方对腺嘌呤所致慢性肾衰竭大鼠肾功能的影响

周微，杨秀炜*

(辽宁省中医药研究院 辽宁中医药大学附属第二医院，沈阳110034)

目的观察益肾排毒方对腺嘌呤所致慢性肾衰竭大鼠肾功能的影响。方法103只清洁级Wister雄性大鼠，随机分为正常组、模型组、对照组(尿毒清颗粒)、治疗组(低、中、高剂量)6组，除正常组外，其余组均给予1.5%腺嘌呤混悬液按300 mg/(kg·d)剂量灌胃给药，造模3周。造模成功后，按大鼠体质量2 mL/100 g，灌胃1次/d，连续8周。正常组、模型组给予自来水灌胃，对照组灌胃尿毒清颗粒混悬液，治疗组分别按相当于人用药剂量的0.5、1、2倍量灌胃中药煎剂益肾排毒方。给药8周后观察各组大鼠一般情况、肾功能(BUN、Scr)指标、免疫(α-SMA)指标、电镜下肾脏组织超微结构形态变化。结果与正常组相比，其余各组BUN、Scr水平均显著升高(P<0.01);与模型组相比,其余各组BUN、Scr水平均显著下降(P<0.01)；与模型组相比，其余各组α-SMA水平均有下降趋势,治疗组(高剂量)水平显著下降(P<0.01)；电镜下，模型组均有不同程度肾损伤，对照组和治疗组肾损伤有所改善。结论益肾排毒方可降低慢性肾衰竭大鼠血BUN、Scr水平，下调α-SMA的表达，改善修复受损肾脏组织，改善肾间质纤维化的程度，延缓慢性肾衰竭的进程。

腺嘌呤；慢性肾衰竭；肾功能；α-SMA

益肾排毒方是我科临床常用的经验方，应用广泛，疗效显著，近年来已通过临床试验验证[1]。笔者通过本实验观察益肾排毒方对腺嘌呤所致慢性肾衰竭大鼠肾功能的影响，为进一步探讨该药物的作用机制提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料清洁级Wister雄性大鼠共103只，平均体质量(250±20)g，由辽宁长生生物技术有限公司提供。饮用水为自来水，饲料为标准大鼠饲料，由北京科澳协力饲料有限公司提供。

益肾排毒方：黄芪、当归、菟丝子、生地黄、白术、茯苓、枸杞子、何首乌、炙甘草、鹿角霜、大黄、黄连、土茯苓、红花等中药组成，将上述中药加水500 mL按中药常规煎法制成，由辽宁中医药大学附属第二医院制剂室制备，含生药 0.375 g/mL。尿毒清颗粒(无糖型)5 g/袋，康臣药业(内蒙古)有限责任公司生产，批号：20131246，临用配成水溶液，含生药0.18 g/mL。

腺嘌呤购自沈阳皇姑区泰吉区生物试剂经销部，美国Amresco 0183进口分装，临用配成1.5%水溶液。大鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)酶联免疫检测试剂盒购于沈阳海灵兴业商贸有限公司。

1.2方法

1.2.1实验分组103只大鼠随机分为正常组13只，模型组、对照组(尿毒清颗粒)、治疗组(低、中、高剂量)5组，每组18只。

1.2.2造模制备各组大鼠每周称重1次，除正常组外，其余组每日上午均给予1.5%腺嘌呤混悬液按300 mg/(kg·d)剂量(即按大鼠体质量2 mL/100 g)灌胃给药[2]，造模3周。造模期间死亡8只。造模后随机选取4只大鼠，眼眶取血2 mL，送检化验肾功能BUN、Scr指标；而后处死取肾组织观察其病理显示为炎性细胞浸润、肾间质纤维化、肾小管结晶物沉着，确定造模成功。

1.2.3给药方法各组大鼠每周称重1次，按大鼠体质量2 mL/100 g灌胃,1次/d，连续8周。正常组、模型组给予自来水灌胃，其余组根据大鼠与成人体质量等效药物剂量计算[3]，对照组按相当于成人用药剂量最大量(0.18 g/mL)灌胃尿毒清颗粒混悬液，分别按相当于人用药剂量的0.5(0.1875 g/mL)、1(0.375 g/mL)、2(0.75 g/mL)倍量灌胃中药煎剂益肾排毒方。给药期间各组合计死亡13只。

1.2.4标本采集及取材给药8周后禁食水12 h，次日称体质量，2%乌拉坦麻醉后腹主动脉采血送检生化、免疫；每组大鼠取1只，取右肾，观察外观大小颜色质地等，然后将肾组织肾皮质取约2 mm2若干小块，2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定，乙醇梯度脱水，环氧树脂618包埋，定位后超薄切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，日立H-7650透射电子显微镜下观察肾组织超微结构[4]。

2　结果

2.1一般情况造模期间正常组13只大鼠均反应灵敏，体毛光泽顺滑，体质量增加快，饮食二便正常，无死亡。其余各组精神萎靡，饮食减少，体毛干枯无光泽，活动减少，体质量增加慢，小便多，大便稀溏。给予干预措施后对照组和治疗组精神较前有所改善，饮食活动较前有所增加，但不如正常组状态。各组大鼠治疗后体质量比较，见表1。

表1　各组大鼠治疗后体质量比较±s)

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01；与对照组比较，▲P<0.05；与低剂量组比较，★P<0.05

2.2生化指标(BUN、Scr)比较见表2。

表2　各组大鼠肾功能(BUN、Scr)比较

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01；与对照组比较，▲P<0.05；与低剂量组比较，☆P<0.05，与中剂量组比较，★P<0.05

2.3免疫指标(α-SMA) 比较见表3。

表3　各组大鼠治疗后α-SMA比较

注：与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与低剂量组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.4肾脏形态学改变

2.4.1肉眼观察正常组大鼠肾脏大小如花生，颜色暗红，表面光滑。其余组大鼠肾脏明显增大，颜色苍白，表面粗糙不平。

2.4.2电镜观察正常组肾小球数目正常，无纤维化；肾小管排列紧密，无肿胀变形。模型组肾小球数目减少，基底膜部分增厚，管腔狭窄，肾小管上皮细胞内褶线粒体肿胀消失。对照组、治疗组(低、中剂量)肾小球基底膜部分增厚，肾小管上皮细胞线粒体肿胀。治疗组(高剂量)肾小球基底膜完整，肾小管上皮细胞线粒体完整。

3　讨论

慢性肾衰竭属中医“溺毒”“癃闭”“关格”“肾劳”“虚劳”等范畴[5]，病机总属本虚标实，主要为气血阴阳俱虚，湿浊血瘀内蕴，笔者根据病机研制出益气补血、调补阴阳、解毒泄浊之益肾排毒方。方中黄芪、白术、当归、何首乌、茯苓益气补血，健脾除湿；菟丝子、生地黄、枸杞子、鹿角霜调补阴阳；大黄泄浊排毒；黄连、土茯苓清热利湿；红花活血化瘀。现代药理表明：黄芪具有增强机体免疫功能、抗氧化、神经修复等广泛功效[6]。白术、菟丝子能抗氧化、参与体内多种免疫调节反应、增强免疫力[7-8]。当归具有抵抗血小板凝集，促进人体造血作用[9]。何首乌具有提高免疫、促进造血细胞生长、抗菌抗炎等作用[10]。茯苓具有抗肿瘤、抗纤维化、抗炎、抗氧化、免疫调节等多方面的药理作用[11]。枸杞子具有增强免疫功能和保护肾功能作用[12]。生地黄具有调节机体免疫系统,参与维护机体稳定的作用[13]。大黄主要具有显著减少肾间质病变，改善抑制肾间质纤维化的作用[14]。红花具有抗血小板聚集、降低血液黏度、扩张微细动脉、改善微循环以及清除氧自由基、抗氧化的作用[15]。

本实验观察益肾排毒方对腺嘌呤致慢性肾衰竭大鼠肾功能的影响，结果表明益肾排毒方能有效地降低慢性肾衰竭大鼠的BUN、Scr水平，尤其是高剂量组效果更为显著，低、中剂量组疗效和对照组疗效相当，与模型组比较均有显著差异(P<0.01)，证实了益肾排毒方的疗效，也间接证实了中医剂量与临床疗效之间的关系。同时，通过电镜对慢性肾衰竭大鼠模型肾脏组织的观察，模型组肾组织肾小球基底膜增厚，管腔狭窄，肾小管上皮细胞内褶线粒体肿胀消失。通过药物干预后，对照组、治疗组(低、中剂量)肾小球基底膜部分增厚，肾小管上皮细胞线粒体肿胀减轻；治疗组(高剂量)肾小球基底膜完整，肾小管上皮细胞线粒体完整。证实益肾排毒方能修复肾小球和肾小管的损害病变[16-17]。本研究中观察了慢性肾衰竭大鼠的血清α-SMA水平，研究结果表明模型组、对照组、各治疗组α-SMA均较正常组升高，尤其以模型组水平最高；治疗组(高剂量)水平虽较正常组升高但无明显差异。与模型组相比，其余各组α-SMA水平均有下降趋势，其中治疗组(中、高剂量)水平显著下降。与对照组相比，各治疗组(低、中、高剂量)水平无明显差异，治疗组组间相比，治疗组(中剂量)水平下降；治疗组(高剂量)水平显著下降。本研究结论提示中药益肾排毒方治疗组可下调α-SMA的表达，从而减少ECM的过度沉积而改善肾间质纤维化的程度，最终达到延缓慢性肾衰竭的进程。

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Yishen Paidu formula on renal function in rats with chronic renal failure caused by adenine

ZHOU Wei,YANG Xiuwei*

(Liaoning Institute of Traditional Chinese Medicine,The Second Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110034,China)

ObjectiveTo explore the clinical effect of Yishen Paidu Formula on the renal function in rats with Chronic renal failure caused by Adenine.MethodsThe 103 clean male Wister rats have been randomly divided into six groups,these are normal group,model group,control group (niaoduqing granules),treatment group (low-dose,meta-dose,and high-dose).Except for the normal group,the other groups are given 1.5% adenine mixed suspension with 300 mg/kg.d intragastrically administration,and the model is established for 3 weeks.After the model is established,each rat is lavaged based on its weight 2 mL/100 g one time a day,and the process lasts for 8 weeks.The normal group and model group are lavaged with running water,the control group is lavaged with niaoduqing granules mixed suspension,three treatment groups are lavaged with half,one time and twice dosages traditional Chinese medicine Yishen Paidu Formula respectively.After eight weeks of lavage,to rats in each group,the general state of health,renal function (BUN,Scr) indicator,α-SMA with immunohistochemistry and kidney tissue ultrastructure morphological change under electron microscope were observed.ResultsCompared with the normal group,the BUN and Scr levels in the other groups increase significantly (P<0.01).Compared with the model group,the BUN and Scr levels in the other groups decreases significantly (P<0.01),the α-SMA levels in the other groups decreases and in the treatment group(high-dose) decreases significantly (P<0.01).Under electron microscope,there are kidney damages with different degrees in each rat in model group,and there are improved kidney damages in each rat in control and treatment group.ConclusionYishen Paidu Formula can reduce the chronic renal failure rats blood BUN,Scr andα-SMA level,improve and repair the damaged kidney tissue,reduce interstitial fibrosis and prolong the process of CRF.

adenine;chronic renal failure;renal function;α-SMA

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.007

辽宁省科学事业公益研究基金项目“益肾排毒方治疗腺嘌呤致慢性肾衰竭大鼠模型的药效学研究”(2012002012)；沈阳市科技计划项目“益肾活血降浊法治疗腺嘌呤致大鼠慢性肾衰竭的实验研究”(F15-139-9-41)。

周微(1981-)，女，硕士，主治医师，主要从事中西医结合治疗慢性肾脏病。

杨秀炜，女，硕士，主任医师，电话-13514282347，电子信箱-weiweium@126.com

R285.5

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2095-6258(2016)05-0898-04

2016-05-10)