益气活血复方对动脉粥样硬化家兔NF-κB基因表达的影响

柳士博,张　艳，礼　海,朱洁洁

(1.抚顺市中医院,辽宁 抚顺 113008；2.辽宁中医药大学附属医院,沈阳 110032；3.沈阳市第二中医医院，沈阳110101)



·实验研究·

益气活血复方对动脉粥样硬化家兔NF-κB基因表达的影响

柳士博1,张艳2*，礼海3,朱洁洁1

(1.抚顺市中医院,辽宁 抚顺 113008；2.辽宁中医药大学附属医院,沈阳 110032；3.沈阳市第二中医医院，沈阳110101)

目的探讨益气活血复方对家兔颈总动脉球囊损伤模型CRP水平及NF-κB基因表达的影响。方法采用颈总动脉球囊损伤联合高脂饲料喂养家兔的实验方法。筛选家兔40只，随机分为模型组、西药对照组、治疗组、正常组,共4组。各组家兔于8周末，清晨空腹经耳中央动脉采血,分离血浆。处死家兔后取颈总动脉组织，测定NF-κB基因表达。结果治疗组、西药对照组与模型组比较(P<0.01)，都能降低血浆CRP水平；与治疗组比较，西药对照组CRP水平下降更为明显。治疗组、西药对照组均能下调NF-κB基因表达，但无统计学意义(P>0.05)，与正常组比较无统计学意义(P>0.05)。结论益气活血复方能够降低血浆CRP水平，下调NF-κB基因表达，具有明显的拮抗炎症反应的作用，有利于缓解动脉粥样硬化的发生发展。

益气活血复方；动脉粥样硬化；NF-κB；CRP

动脉粥样硬化(AS)导致最常见的器官病变是冠心病[1]。预防和治疗动脉粥样硬化是降低冠心病病死率，并提高患者预后及生活质量的有效途径。益气活血复方是恩师从医多年的临床经验方，治疗冠心病取得满意临床疗效[2]。本实验研究采用家兔高脂环境下的颈动脉内皮球囊损伤模型[3]，应用益气活血复方干预,观测其对动脉粥样硬化家兔血浆CRP水平及NF-κB基因表达的影响[4]。旨在从分子生物学水平探讨益气活血复方对在体动物AS的干预作用。

1　材料

1.1实验动物选取健康6月龄雄性新西兰大耳白兔40只，体质量(2.48±0.35)kg。由辽宁中医药大学实验动物中心提供，普通级。

1.2实验药物益气活血复方由黄芪、当归、桃仁、红花等药物组成。辽宁省中医研究院剂型研究室制备，含4.87 g/g生药。西药对照药：辛伐他汀片，10 mg/片(上海信谊万象药业股份有限公司生产，批号：061201)。胆固醇(天津市福晨化学试剂厂生产，批号：2040612)。

1.3试剂与仪器RT-PCR试剂盒：大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)，批号：Bk2201。DNA-marker DL2000：大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)，批号：CB3301。NF-κB、GAPDH内参照由宝生物工程(大连)有限公司合成。球囊导管及手推式压力泵：美国Boston Scientific公司，MAV-MR 20 mmΧ20 mm,CE0197。全自动生化分析仪：日立7600型。低温高速离心机：德国，型号HERAEUS BIOFUGE28R。PCR仪：美国PERKIN ELMER，型号PE9600。

2　方法

2.1动物分组及取材动物适应性喂养1周后，随机分成2组。6只喂以标准兔饲料的正常对照组，34只喂以高胆固醇饲料的手术组。手术组34只新西兰大耳白兔行颈总动脉球囊损伤术。4周后，完成颈总动脉球囊损伤术的动物根据血脂水平、动物体质量等指标，随机分为模型组、西药对照药辛伐他汀组(西药对照组)、益气活血复方组(治疗组)。由于在造模过程中死亡4只，所以模型组、西药对照组、治疗组每组各10只。加正常组，共4组。各给药组在每天清晨只喂食药物饲料，待吃完后，再加足高胆固醇饲料；模型组喂以高胆固醇饲料；正常组则只供普通饲料饲养。实验组家兔每周称体质量1次，根据体质量调整每只实验动物的给药量，共给药4周。第8周末，处死所有家兔后，分离颈总动脉损伤血管段，正常组取其颈总动脉相对应处，结扎两端后剪取放入DEPC处理弹头管中，-80 ℃保存。

2.2给药剂量辛伐他汀5 mg/(kg·d)，益气活血复方颗粒1 g/(kg·d)。

2.3指标测定

2.3.1血浆CRP水平测定各组家兔于8周末，清晨空腹称重后，经耳中央动脉采血4 mL，EDTA抗凝，分离血浆，-80 ℃保存。

2.3.2RT-PCR方法测定血管内皮(组织)中NF-κB基因表达1)血管壁总RNA提取、RT-PCR扩增反应:取动脉血管0.5 cm,按试剂盒说明操作。PCR反应参数：94 ℃变性3 min后进入循环,94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30个循环,72 ℃延伸5 min。2)定量分析：取10 μL PCR反应产物，加入6×溴酚兰上样缓冲液2 μL后上样，于配加了溴乙锭的2%的琼脂糖凝胶上电泳,应用Bio-Rad Gel Doc 1 000成像系统采集实验结果图像，并用凝胶成像分析系统GIS120D对图像条带进行灰度扫描，以GAPDH为内参基准作半定量分析，测定样本NF-κB基因的相对表达量。

3　结果

3.1各组家兔一般状况比较正常组家兔一般状况良好，被毛丰厚细密，富有光泽，皮肤紧密结实，门齿洁白整齐，耳长直立，精神饱满，日常活动、饮水及采食积极，食欲佳。造模后家兔一般状况欠佳，被毛粗糙无光泽，皮肤厚而松弛，日常活动量明显减少，多静伏，精神不振，食欲欠佳。在给药的4周后，治疗组、西药对照组的家兔一般状况明显改善，精神转佳，活动、采食频繁。模型组一般状况无明显改善。

3.2各组家兔血浆CRP水平比较见表1。

1　各组家兔血浆C反应蛋白变化情况±s)

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与治疗组比较，▲P<0.05

3.3各组家兔NF-κB基因表达比较见表2。

表2　各组家兔动脉组织NF-κB mRNA表达的比较

注：与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

4　讨论

中医学将冠心病[5-10]归属于“胸痹”范畴，认为其以气虚为本，血瘀为标，具有本虚标实的病理特点。追溯至《素问·阴阳应象大论》：“阴盛则阳病”“气虚宜掣引之”的论述，气属阳血属阴，本着“气行则血行”“血实宜决之”扶正祛邪的原则，治以扶阳益气为主，辅以活血化瘀，以达气旺则血充，气行则血畅，气血调和之目的[11]。黄芪、当归、桃仁、红花是本实验研究中益气活血复方的主要组方药物，具有显著的补虚化瘀之功效。现代药理实验表明，黄芪总提取物在体外抗血栓形成、增强机体清除氧自由基能力及降低氧化应激反应等方面具有显著作用[12]。当归、川芎两药为临床常见的配伍佳对，二者气血兼顾，补而不滞，活血行血而性质柔润。药理学实验也证实了两者配伍可明显增强血管内皮细胞的保护作用，降低血管阻力，提高机体的抗氧化活性[13]。红花中含有高达85%的羟基红花黄色素，能显著改善冠状动脉的血流动力学及凝血机制，延长APTT[14]，其与桃仁配伍具有极佳的活血化瘀功效。冠心病动脉粥样硬化的形成即“血瘀证状态”，其因炎症累及所致的内皮损伤，心肌能量代谢的关键酶活性异常等因素均对AS的形成起促进作用[15]。

本实验研究结果表明，益气活血复方能够降低血浆CRP水平，下调颈总动脉球囊损伤术后家兔NF-κB基因表达，NF-κB表达减少后，由之调控的有关炎性因子和生长因子的表达也会随之降低，从而达到明显的拮抗炎症反应的作用。益气活血复方可能是通过一系列复杂机制以影响Kappa-B激酶抑制剂的活性，使NF-κB无法通过细胞质进入到细胞核内，失去了与DNA结合的机会，最终实现降低NF-κB的表达，降低炎症反应的目的[16]。由此可见，益气活血复方具有明显的防治动脉粥样硬化的作用。与西药相比疗效相近，且具有不良反应少、毒性低的优点。本实验可为益气活血中药防治动脉粥样硬化提供科学的实验依据。

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Yiqihuoxue compound on expression of atherosclerosis in rabbits NF-κB gene

LIU Shibo1,ZHANG Yan2*,LI Hai3,ZHU Jiejie1

(1.Fushun Hospital of Traditional Chinese Medicine,Fushun 113008,Liaoning Province,China;2.The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;3.The Second Shenyang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110101,China)

ObjectiveTo observing the effect of the formula of Supplementing Qi and activating blood circulation on the CRP level and the expression of NF- kappa B in the rabbit carotid artery balloon injury model,the effect mechanism of the prescription for supplementing qi and activating blood circulation in the treatment of atherosclerosis was discussed.MethodsCommon carotid artery injury combined with high-fat diet fed rabbits experimentally.Screening of 40 rabbits were randomly divided into model group,western medicine control group,the treatment group,plus the normal control group,a total of four groups of rabbits.Rabbits in each group of 8 weeks,fasting blood by ear central artery,plasma separated.Rabbits were sacrificed after taking carotid artery tissue,measuring gene expression NF-κB.ResultsTreatment group,western medicine group and the model group (P<0.01),can reduce plasma CRP levels;compared with the treatment group and comparison group CRP levels decreased more obvious.NF-κB gene therapy group,comparison group can be reduced,there was no significant difference (P>0.05),no difference (P>0.05) and the normal group.ConclusionYiqihuoxue compound capable of lowering plasma CRP levels,reduced NF-κB gene expression,has obvious antagonistic role of inflammation,and help alleviate the development of atherosclerosis.

Yiqihuoxue compound;atherosclerosis;NF-κB;CRP

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.006

辽宁省科技厅自然科学基金“益气活血中药防治PTCA术后再狭窄的临床及实验研究”(20062073)。

柳士博(1983-)，女，硕士研究生，主治中医师，主要从事中西医结合治疗心血管病临床研究。

张艳，女，主任医师，博士研究生导师，电话-1388929805，电子信箱-Yanzhang1016@126.com

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2095-6258(2016)05-0895-03

2016-05-24)