基于WSC-9的人工组建的简化复合菌系的纤维素分解能力与酶活特性

张杨，李莹，艾士奇，方旭，刘小胖，王归归，高亚梅，王伟东

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆　163319）

基于WSC-9的人工组建的简化复合菌系的纤维素分解能力与酶活特性

张杨，李莹，艾士奇，方旭，刘小胖，王归归，高亚梅，王伟东

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆163319）

为了研究复合菌系分解纤维素的分解特性，将从复合菌系中分离的一株厌氧细菌WSC-B（Clostridium sp.）与另外2株好氧细菌（Bacillus sp.和Clostridiaceae sp.）重新组合为一个新的复合菌系F1，通过减重法分析F1纤维素分解能力，利用3，5-二硝基水杨酸显色法（DNS法）分析F1产生的几种纤维素酶的活性。结果表明：复合菌系在接种后10 d可使水稻秸秆和滤纸分别减重73.9%和70.6%。WSC-B、WSC-A、WSC-5比例为3∶2∶1时，降解效果最佳。复合菌系F1的纤维素滤纸酶活、外切酶、内切酶、β-葡萄糖苷酶的最大值分别为16.26 U·mL-1、56.25 U·mL-1、30.67 U·mL-1和10.81 U·mL-1。

纤维素；复合菌系；酶活；生物降解

我国的纤维素资源丰富，仅每年的农林废弃物就有近10×108t，农作物秸秆年产量近7×108t［1］，但这些纤维素资源并未得到充分的利用，急需找到秸秆资源化利用的办法［2-3］。采用微生物降解纤维素是解决这一问题的有效手段之一，因而近年来关于细菌产纤维素降解酶的研究日益引起人们的重视［4］。

已报道的降解纤维素的细菌主要包括好氧菌属中的热酸菌（Acidothermus）、芽孢杆菌（Bacillus）、热杆菌（Caldibacillus）、纤维弧菌（Cellvibrio）等［5-6］，厌氧菌属中的厌氧解纤维菌（Anaerocellum）、热解纤维素菌（Caldicellulosiruptor）、梭菌（Clostridium）等［7］。降解纤维素的真菌有木霉属（Trichoderma）［8］、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）［9］。但单一菌株难以达到降解的目的，需要多个菌种的协同作用。多种纤维素降解菌协同作用可分泌多种纤维素酶［13］：内切型纤维素酶、外切型纤维素酶和葡糖苷酶，不同菌源的内切与外切酶之间也具有协同作用，从而能够快速将纤维素降解［14］。刘长莉［10］经驯化筛选出复合菌系NSC-7，培养5 d，降解稻秆总干重的44.7%；王伟东等［11］构建的复合菌系WSC-6，培养3 d内，滤纸和稻秆的降解率可达到97%和82.2%；温雪［12］将两株具有较强分解能力的菌株与一株无纤维素分解能力的菌株进行人工组合，发现组合菌群的纤维素分解能力较单独的菌株分解能力稳定而高效；Stepanova等［18］将白腐菌与丝状真菌以燕麦秸秆为碳源进行混合培养，发现相对于单独培养纤维素和木质素降解菌有提高；Kato等［19］通过研究复合系MC1中主要菌株的关系，发现非纤维素降解菌在纤维素的降解中具有重要的作用，通过对关键菌株重新优化组合，其纤维素的降解能力要高于单一菌株的降解能力。

经前期研究得到一个具有高效纤维素降解能力的复合菌系WSC-9，从中分离得到了8株细菌，其中菌株WSC-B（Clostridium sp.）能在厌氧条件下快速高效降解纤维素［12］。为了将来研究复合菌系的纤维素协同降解机制，此次研究以细菌WSC-B为核心，与其余7株细菌中的1-2株重新人工组配，期望得到一个组成简单且高效快速降解纤维素的新复合菌系，然后研究新复合菌系的纤维素分解能力和酶活特性，为研究复合菌系的纤维素降解机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验菌种

实验室分离得到的5株好氧细菌和3株厌氧细菌，分别命名为WSC-1、WSC-2、WSC-3、WSC-4和WSC-5及WSC-A、WSC-B和WSC-C，见参考文献［12］。

1.2培养条件

好氧菌使用PCS培养基，其组成成分为（g·L-1）：酵母粉1，蛋白胨5，NaCl 5，CaCO32。在50 mL三角瓶中加入40 mL培养基，秸秆和滤纸的添加量为培养基体积的2%，121℃灭菌15 min。接菌量为10%，50℃下静置培养10 d。

厌氧菌培养基成分为（g·L-1）：酵母粉2，蛋白胨2，NaCl 1，KCl 0.2，MgCl20.5，NH4Cl 1，K2HPO4·3H2O 3.5，KH2PO41.5，煮沸后加入L-半胱氨酸0.5，微量元素5 mL，维生素1 mL，1‰刃天青5～6滴。煮沸的同时，用注射器向100 mL青霉素瓶中加入70 mL培养基，同时氮气制造厌氧环境，秸秆和滤纸的添加量为培养基体积的2%，121℃灭菌15 min。接菌量为10%，50℃下静置培养10 d。

试验中所使用的秸秆为水稻秸秆，前处理方法为：1%NaOH浸泡24 h后用自来水冲洗至pH为7.0，在80℃下烘干。

1.3复合系的组建

以细菌WSC-B为核心，将它分别与其他几株细菌进行组合，每个组合最多3株细菌；培养条件和方法与好氧菌的培养条件相同。对有降解情况发生的组合多次传代培养，直至其能稳定降解。培养10 d后，按1.6.1测定降解率。

1.4较优组合各菌株添加比例

接菌量为10%不变，设置3因素3水平正交试验，菌株的添加比例见表1。培养条件和方法与好氧菌的培养条件相同，3株细菌的添加总量不变，各菌的添加量根据比例计算后添加。每组做3个平行。培养10 d后，按1.6.1测定降解率。

表1　菌株添加比例正交实验表Table 1Orthogonal table of strain add proportion

1.5复合菌系F1纤维素降解过程与纤维素降解有关的酶活性变化

分别测定与纤维素降解有关的4种酶活性：滤纸酶活性、纤维素内切酶、纤维素外切酶和β-葡萄糖苷酶。所选择的底物分别为滤纸、羧甲基纤维素钠（CMC）、微晶纤维素粉和水杨苷。

1.6测定方法

1.6.1降解率的测定方法

在培养前，测定所添加的滤纸和秸秆的干重；降解后，收集降解剩余的滤纸和秸秆，80℃下烘干至恒重，测定其质量；从而计算降解率。

1.6.2标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线按照参考文献［15］绘制。

缓冲溶液为5.59 g·L-1磷酸氢二钾和0.41 g·L-1磷酸二氢钾配制成pH为7.8的磷酸盐缓冲液。

1.6.3与纤维素降解有关的4种酶活性测定

（1）粗酶液的提取

在接种后的第二天开始，每天取一定的培养液于2 mL离心管中，8 000 rpm离心10 min后收集上清液［16］，用于酶活性的测定。

（2）4种酶活性测定

测定方法采用3，5-二硝基水杨酸显色法（DNS法）。方法见参考文献［15］。

1.6.4分析方法

利用SPSS 17.0进行统计分析。

2　结果

2.1复合菌系的组建

因为要组建一组培养条件与原纤维素降解复合菌系的培养条件相同的复合菌系，因此，试验中的每个组合至少包含一株好氧单菌。结果发现，当WSC-B与WSC-A、WSC-3及与WSC-A、WSC-5组合，有降解现象产生，其降解效率如表2所示。

表2　组建的复合系对滤纸和秸秆的降解率Table 2Filter paper and straw degradation rate of composite bacterial system

由以上结果可知，当WSC-B与WSC-A、WSC-5组合时，滤纸和秸秆的降解率均是最高的，与WSCB、WSC-A、WSC-5组合的差异显著（P＜0.05），表明其降解效果好，因此选择该组合为所需复合系，将其命名为F1。

2.2菌种添加比例

培养10 d后滤纸和秸秆的降解率如表3所示。

表3　三株细菌不同添加量的降解效果Table 3Cellulose degradation of different composition ratio of three isolates

对以上结果进行统计分析，试验组8的结果与其他试验组结果差异显著（P＜0.05），即当3株单菌的添加比例为3∶2∶1时，其降解效果最好，滤纸的降解量达到了70.6%，秸秆的降解量为73.9%。

2.3新复合菌系F1与纤维素降解有关的酶活性变化

新复合菌系F1与纤维素降解有关的酶活性变化如图1所示。

图1　纤维素分解过程中酶活性的变化Fig.1Dynamic of cellulase activity during cellulose decomposition process

图1将原纤维素降解复合菌系WSC-9和组建的复合菌系F1的4种酶活性进行了比较。当反应温度与培养温度相同时，二者的酶活性的变化的整体趋势相同，均为先升高后降低，且都是在纤维素分解最旺盛时期各种酶的酶活达到最大值。复合菌系WSC-9和F1的滤纸酶活性都在第5 d达到最大，分别为17.53 U·mL-1和16.26 U·mL-1，二者的滤纸酶活性相差不大。WSC-9和F1的内切酶活性都在第6 d达到最大值，分别为51.48 U·mL-1和30.67 U·mL-1，F1的最大内切酶活性比WSC-9的内切酶活性低40%。WSC-9的外切酶活性在第5 d达到最大值，为75.68 U·mL-1；但F1的外切酶活性在第6 d时最大，为56.25 U·mL-1，与WSC-9相比低了25.7%。WSC-9和F1的β-葡萄糖苷酶都在第6 d时达到最大值，分别为11.77 U·mL-1和10.81 U·mL-1，差异不显著。

3　讨论与结论

通过组配试验得到的纤维素降解复合菌系F1，组成为三株单菌，能够在短时间内快速高效的将纤维素分解，其降解效率能够达到原复合菌系的80%以上，达到了既简化菌系组成又具有较高纤维素分解能力。F1中有一株好氧细菌，它可能在培养的初期利用了培养体系中的氧气，制造了缺氧环境，为具有降解作用的细菌WSC-B和WSC-A创造了厌氧环境，从而使两株厌氧菌得以繁殖生长，进而三者协同作用分解滤纸。复合菌系F1的三株组成细菌WSCB、WSC-A、WSC-5的混合比例为3∶2∶1时，复合菌系F1的降解效果最佳，也说明具有纤维素分解能力的厌氧菌F1是最关键的菌株，它主导复合菌系的分解能力。

复合菌系F1的纤维素内切酶和纤维素外切酶活性分别比原复合菌系降低了40%和25.7%，滤纸酶活性和β-葡萄糖苷酶活性与原复合菌系的酶活性相当，但F1的纤维素降解效率依旧能够达到原复合菌系的80%以上，证明纤维素分解是在多种纤维素酶的协同作用下完成的，是一个复杂的生物学过程，不能简单的从一种酶活性的高低来判断一株细菌的纤维素分解能力。而在几种纤维素酶活性指标中，最能够反映纤维素分解能力的指标是滤纸酶活，这个硬指标是其他酶活所不能比拟的。因此，在纤维素微生物分解研究中，不论是复合菌系还是纯培养菌株，如果衡量其酶活性，用滤纸酶活具有可比性。

通过把好氧细菌和厌氧细菌优化组配，得到了简化的、具有较高纤维素分解能力的复合菌系，仅由三株细菌组成，在10 d的培养周期内可使水稻秸秆和滤纸分别减重73.9%和70.6%，为下一步研究组成明确的复合菌系的纤维素降解机制奠定了基础。由此也可说明其他菌株对纤维素降解也有一定作用，尤其是WSC-3。

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Capability of Cellulose Degradation and Enzyme Activities of Simplified Artificial Composite Microbial System Based on WSC-9

Zhang Yang，Li Ying，Ai Shiqi，Fang Xu，Liu Xiaopang，Wang Guigui，Gao Yamei，Wang Weidong
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to study the decomposition characteristics of cellulose degradation of composite microbial system（CMS），one anaerobic bacteria strain WSC-B（Clostridiumsp.）that separated from CMS and two aerobic bacteria strains（Bacillus sp.and Clostridiaceae sp.）were recombined a new simple of efficient CMS F1.The cellulose degradation ability of CMS F1 was analyzed by using the gravimetry.3，5-dinitrosalicylic acid development method（DNS）was used to analyze the enzyme activity of CMS.The results showed that the lose ratio of rice straw and filter paper were 73.9%and 70.6%after inoculation first 10 days，respectively. When the ratio of WSC-B，WSC-A and WSC-5 was 3∶2∶1，the degradation effect was the best，the maximum values of cellulose filter paper enzyme activity，exonuclease，endonuclease and β-glucosaccharase of CMS F1were 16.26 U·mL-1，56.25 U·mL-1，30.67 U·mL-1and 10.81 U·mL-1，respectively.

cellulose；composite microbial system；enzyme activity；biodegradation

Q939

A

1002-2090（2016）02-0080-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.02.016

2014-12-31

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD12B05-3）；黑龙江省高校科技创新团队项目（2012TD006）；黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目（YJSCX2014-Y51）；黑龙江省大学生创新项目（20141022311）。

张杨（1989-），女，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院2012级硕士研究生。

王伟东，男，教授，博士研究生导师，E-mail：wwdccy@126.com。