长链非编码RNA HOTAIR影响人舌鳞癌细胞Tb3.1增殖与凋亡的体内外研究

郭文宇，孔令平，孙姗姗，王宇，赵明慧，周旋，王旭东，张仑

细胞与分子生物学

长链非编码RNA HOTAIR影响人舌鳞癌细胞Tb3.1增殖与凋亡的体内外研究

郭文宇，孔令平，孙姗姗，王宇，赵明慧，周旋，王旭东，张仑△

目的研究长链非编码RNA HOTAIR对人舌鳞癌细胞系Tb3.1增殖与凋亡的影响。方法使用HOTAIR siRNA（siHOTAIR）敲低HOTAIR的表达；实验分为siHOTAIR组、无义序列组和空白对照组。前2组分别用siHOTAIR和无义序列转染舌鳞癌细胞，空白对照组细胞不做任何处理。实时定量PCR检测HOTAIR的表达水平；四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测Tb3.1细胞增殖；Western blot检测B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）、BAX的表达；流式细胞仪检测细胞凋亡；平板克隆形成实验检测细胞增殖情况；并行细胞衰老检测。动物实验建立Tb3.1裸鼠皮下荷瘤模型，通过免疫组织化学染色及TUNEL法评价干扰HOTAIR后对Tb3.1细胞增殖、凋亡的作用。结果siHOTAIR处理后HOTAIR的表达水平降低；Western blot结果示Cleaved Caspase-3和BAX表达水平升高，Bcl-2表达水平降低。MTT结果显示siHOTAIR组细胞增殖受到抑制；流式细胞示siHOTAIR组细胞凋亡升高；细胞衰老实验显示siHOTAIR组细胞衰老数目增加；免疫组化结果显示，siHOTAIR组较对照组Ki-67、Bcl-2表达减少，Caspase-3、BAX表达增加；TUNEL结果显示，siHOTAIR组较空白对照组肿瘤细胞凋亡水平升高。结论干扰HOTAIR可以促进舌鳞癌细胞的凋亡并抑制其增殖，HOTAIR可以作为舌鳞癌治疗的研究方向。

舌肿瘤；癌，鳞状细胞；RNA，小分子干扰；细胞增殖；细胞凋亡；HOTAIR

口腔鳞癌居恶性肿瘤发病率第6位，在全世界每年口腔鳞癌的发病人数达500万例［1-2］。近年来，虽然采用了手术、放化疗等综合性的治疗措施，患者的5年生存率仍不到50%［3-4］。肿瘤细胞的增殖和凋亡对于肿瘤进展起重要作用［5］。而口腔鳞癌以舌鳞癌为主，因此研究舌鳞癌细胞的增殖和凋亡对于进一步认识舌鳞癌生物学行为有重要意义。研究表明，长链非编码RNAHOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）作为癌基因可通过促进肿瘤细胞增殖、减少细胞凋亡加快肿瘤的进展［6］，但其在舌鳞癌中的作用鲜有报道。本研究旨在通过体内体外实验探讨HOTAIR对舌鳞癌细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞与试剂人舌鳞癌细胞系Tb3.1受赠于上海交通大学第九人民医院。胎牛血清（2 mmol/L L-谷氨酰胺基本培养基）购自美国Hyclone公司。siRNA购自苏州吉玛基因股份有限公司。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。基因扩增试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。细胞凋亡试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。BAX抗体购自中国博士德生物工程有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体购自美国CST公司；B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、Ki-67抗体、二抗、三抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。化学发光底物购自美国Pierce公司。PVDF膜、TUNEL原位凋亡试剂盒购自美国Roche公司。流式细胞检测细胞凋亡试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。4周龄SPF级雌性裸鼠BALB/C-nu购自中国医学科学院实验动物研究所，体质量15～18 g，饲养于天津医科大学总医院神经病学研究所。

1.1.2 仪器细胞孵箱（美国Thermo公司）。实时定量基因扩增仪CFX96（美国Bio-Rad公司）。激光扫描共聚焦显微镜、DP-70倒置显微镜（日本Olympus公司）。流式细胞仪BD FACSCantoⅡ（美国BD公司）。

1.2 细胞研究

1.2.1 细胞培养细胞置于含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2 实验分组分为3组。siHOTAIR组:HOTAIR干扰序列siHOTAIR转染舌鳞癌细胞Tb3.1。无义序列组:阴性对照siRNA无义序列转染舌鳞癌细胞Tb3.1。空白对照组:舌鳞癌细胞Tb3.1不做任何转染处理。

1.2.3 HTOAIR基因的mRNA表达水平的检测细胞给予处理后，Trizol提取RNA，逆转录合成cDNA。实时定量PCR法将cDNA按照试剂盒配成体系，HOTAIR引物上游:5′-GAGAAAAGGCTGAAATGGAGGACC-3′；下游:5′-TCTTCCCTCCTCTGGCTCTCTCTC-3′。在95℃预变性2 min，95℃15 s，62℃60 s，40个循环。同时给予内参GAPDH相同处理（引物上游:5′-CTCAAGGGCATCCTGGGCTAC-3′，下游5′-CAGCCCCAGCGTCAAAGGT-3′）。对比内参后检测siHOTAIR处理舌鳞癌细胞后，HOTAIR敲低的效果。

1.2.4 四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞存活率取处理后的对数生长期细胞，以2×103/孔密度接种于96孔培养板，37℃分别培养24、48、72、96、120 h，加入10 μL MTT溶液（5 g/L），37℃培养4 h后，2 000 r/min离心10 min，小心吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，于振荡器上振荡15 min，在全自动酶标仪上于570 nm处测定光密度（OD）值。细胞存活率=处理组细胞OD值/空白对照组OD值×100%。

1.2.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测舌鳞癌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、BAX、Cleaved Caspase-3的表达取细胞数目约6×105个加至6孔板中（约1×104个/cm2），按实验分组分别处理3组细胞，24 h后提取总蛋白，使用Nanodrop紫外分光光度计测定总蛋白浓度和纯度，将所需上样量的蛋白经电泳、转膜后，一抗4℃孵育过夜，TBST充分洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000稀释）室温孵育1 h，洗去二抗，将化学发光底物滴加于PVDF膜，胶片曝光成像。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡分别取3组已处理24 h后的细胞，用无EDTA的胰酶消化后，PBS洗2遍，离心，按凯基生物凋亡试剂盒中的方法处理细胞:加入500 μL的binding buffer悬浮细胞，加入5 μL AnnexinV混匀后，加入5 μL Propidium ropidi（PI），混匀，后在流式细胞仪下检测细胞凋亡，其中只能够被Annexin V单染的，而无PI染色的为早期凋亡细胞，根据细胞数目百分比得出凋亡率。

1.2.7 平板克隆形成实验检测细胞增殖情况分别取3组细胞，按1×103/孔密度接种到6孔板中，在细胞培养箱中培养2周，待肉眼可见的细胞克隆形成时终止培养，用4%多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛后，用结晶紫染色10 min，在显微镜下分别取4个视野，用血细胞计数板计数4次求平均值。

1.2.8 细胞衰老检测待6孔板中的3组细胞生长24 h后吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液。37℃孵育过夜，用保鲜膜封住6孔板防止蒸发。光学显微镜下观察。

1.3 动物实验本研究将裸鼠按随机数字表法分为3组: siHOTAIR组、无义序列组、空白对照组，每组5只。用带6号针头的注射器抽取200 μL经胰酶消化、离心、重悬的细胞悬液，细胞浓度为2×107/mL的Tb3.1单细胞悬液分别注射于上述3组裸鼠左侧腹股沟皮下。瘤细胞接种3周后，手术取出皮下荷瘤标本，10%福尔马林固定，石蜡包埋，制备厚度4 μm的石蜡切片。

1.3.1 免疫组织化学检测石蜡切片常规脱蜡水化，抗原修复，3%H2O2孵育，胎牛血清封闭，分别滴加Ki-67、Caspase-3、Bcl-2、BAX一抗（1∶200稀释）。4℃孵育过夜；PBS充分洗涤，加入生物素标记的二抗（1∶100稀释），37℃孵育1 h；洗去二抗，加入辣根过氧化物酶标记的三抗（1∶100稀释），37℃孵育1 h；DAB显色，苏木素复染，梯度脱水，封片；DP-70倒置显微镜采集图像。根据抗体着色深度判断。定性观察按细胞有无显色及染色强度计分:细胞无显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。

1.3.2 TUNEL实验检测细胞凋亡石蜡切片常规脱蜡水化，按照TUNEL原位凋亡试剂盒说明书进行检测。加TUNEL反应混合液，于37℃反应1 h，PBS洗5 min×3次，DAPI染色15 min。水溶性封片剂封片，激光扫描共聚焦显微镜采集图像。蓝色荧光标记为细胞核，绿色荧光标记为断裂DNA片段。以颜色的深浅为判断阴性和阳性的标准，深绿色提示有意义，即为凋亡细胞。通过判断强染色的细胞数目来比较凋亡。

1.4 统计学方法使用SPSS 18.0统计软件包处理实验数据，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siHOTAIR下调HOTAIR的表达空白对照组和无义序列组的Tb3.1舌癌细胞HOTAIR表达水平差异无统计学意义，siHOTAIR组的HOTAIR表达水平较空白对照组和无义序列组明显下降（F= 85.860，n=3，P＜0.01），见图1。

2.2 Tb3.1细胞存活情况培养72 h时，siHOTAIR组细胞存活率最低，24～120 h时siHOTAIR组细胞存活率均低于空白对照组和无义序列组（均P＜0.05），干扰HOTAIR后细胞的增殖受到抑制；各时点空白处理组与无义序列组差异均无统计学意义，见图2。

2.3 Tb3.1凋亡相关蛋白的表达siHOTAIR组Cleaved Caspase-3、BAX蛋白表达较空白对照组和无义序列组显著上调，而Bcl-2蛋白表达显著下调，见图3。

Fig.1The relative expression levels of HOTAIR after transfection of siHOTAIR图1 siHOTAIR处理Tb3.1后HOTAIR的相对表达量

Fig.2Comparison of cell survival rates in different time points between different groups图2 不同时点各组细胞存活率比较

Fig.3Changes of apoptosis related protein after treatment with siHOTAIR图3 siHOTAIR处理Tb3.1后凋亡相关蛋白表达水平的改变

2.4 siHOTAIR后肿瘤细胞的凋亡情况siHOTAIR组细胞凋亡率明显高于空白对照组和无义序列组（n=3，F=36.543，P＜0.01），见图4。

2.5 siHOTAIR后舌癌细胞的增殖情况平板克隆形成实验显示，siHOTAIR组细胞形成克隆的数目明显少于空白对照组和无义序列组（F=10.306，n=3，P＜0.01），提示HOTAIR促进Tb3.1细胞的增殖，见图5、6。

Fig.4Changes of apoptotic rates after treatment with siHOTAIR图4 siHOTAIR处理后细胞凋亡率的改变

Fig.5Cell clone forming ability after treatment with siHOTAIR图5 siHOTAIR处理后细胞克隆形成能力

Fig.6The number of Tb3.1 cell clone after treatment with siHOTAIR图6 siHOTAIR处理Tb3.1后克隆形成数目

2.6 siHOTAIR后舌癌细胞衰老情况siHOTAIR组较空白对照组和无义序列组细胞衰老增加，抑制HOTAIR表达引起了肿瘤细胞衰老比例增加，见图7。

2.7 HOTAIR对舌鳞癌生长的影响免疫组织化学染色结果显示，Ki-67染色空白对照组和无义序列组为深染，siHOTAIR组为淡染。siHOTAIR组较空白对照和无义序列组中Ki-67表达水平下降，肿瘤细胞增殖受到抑制。Bcl-2染色空白对照组和无义序列组为深染，siHOTAIR组为淡染。BAX和Caspase-3染色空白对照组和无义序列组为淡染，siHOTAIR组为深染。siHOTAIR组较空白对照组和无义对照组Bcl-2表达水平降低，BAX、Caspase-3表达水平升高，见图8。

2.8 HOTAIR对舌鳞癌细胞凋亡的影响TUNEL结果显示，siHOTAIR组断裂DNA染色1个视野有12个，空白对照组有2个，无义序列组有2个，提示siHOTAIR组细胞凋亡较空白对照组和无义序列组明显增加，抑制HOTAIR表达促进肿瘤细胞的凋亡，见图9。

Fig.7The senescence of Tb3.1 cells after treatment with siHOTAIR（×400）图7 siHTOAIR处理Tb3.1舌癌细胞后细胞衰老的情况（×400）

3 讨论

3.1 HOTAIR不同层面调控肿瘤的进展HOTAIR是长度为2.2 kb碱基的长链非编码RNA，是Hox基因家族成员［7-9］。HOTAIR通过5′末端结合PRC2复合物，通过3′末端结合LSD1/CoREST/REST复合物，引起组蛋白H3K27三甲基化和H3K4去甲基化，进而沉默相关基因，敲低HOTAIR引起SUZ12和LSD1结合的降低，基因的沉默效果受到抑制［10-11］。HOTAIR在乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、头颈部癌等多种恶性肿瘤中过表达，通过表观遗传学的改变引起了一系列基因的上调或下调来影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡、转移［12］。

3.2 HOTAIR的表达与肿瘤细胞的转移、增殖、凋亡及不良预后有关HOTAIR在骨肉瘤中过表达，下调HOTAIR可以抑制Ki-67、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长和转移［13］。有学者发现，检测HOTAIR在乳腺癌患者血清中的表达水平对于辨别乳腺癌患者的灵敏度高达80%，特异度达68.3%，同时乳腺癌患者的分级与HOTAIR的表达水平呈正相关，因而HOTAIR在血清中的表达水平可以作为潜在的肿瘤生物学标志；干扰HOTAIR后，间质指标N-钙黏蛋白（N-cadherin）、锌指增强子结合蛋白1（ZEB1）、锌指转录因子（slug）、Twist-1下调，细胞上皮间质转化（EMT）受到抑制，HOTAIR参与肿瘤细胞EMT［14］。敲低HOTAIR后胶质瘤细胞中的成视网膜细胞瘤蛋白（RB）、p21和p16均上调，S期细胞比例减少，细胞周期停滞［15］，说明HOTAIR影响肿瘤细胞周期。有学者研究发现在卵巢癌中干扰HOTAIR后，流式细胞仪检测发现细胞凋亡增加，Western blot证实了抗凋亡基因Bcl-2表达水平降低，促凋亡基因Caspase-3、Caspase-9水平增加，表明HOTAIR参与肿瘤细胞凋亡的调控［16］。

3.3 HOTAIR参与调控舌鳞癌细胞Tb3.1的增殖与凋亡本研究中发现siHOTAIR转染Tb3.1舌鳞癌细胞后，HOTAIR表达水平降低，细胞增殖能力下降。siHOTAIR处理细胞后促凋亡基因Cleaved Caspase-3、BAX的表达水平升高，抗凋亡基因Bcl-2的表达水平下降。此外，HOTAIR还能影响舌鳞癌细胞的衰老，干扰HOTAIR表达后细胞衰老比例增加。本研究进一步证实了干扰HOTAIR后，瘤细胞的生长受到抑制、细胞凋亡增加，说明干扰HOTAIR可以抑制舌鳞状癌细胞的增殖及诱导凋亡。

综上所述，敲低HOTAIR具有抑制Tb3.1人舌鳞癌细胞增殖、诱导凋亡的作用。本研究为选择人舌鳞癌细胞基因治疗策略提供了实验依据；HOTAIR是舌鳞癌细胞基因治疗的一个颇具前景的候选靶点。

（图8、9见插页）

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（2015-12-16收稿2016-04-08修回）

（本文编辑李鹏）

Effects of long non-coding RNA HOTAIR on proliferation and apoptosis of human tongue squamous cell carcinoma in vitro and in vivo

GUO Wenyu，KONG Lingping，SUN Shanshan，WANG Yu，ZHAO Minghui，ZHOU Xuan，WANG Xudong，ZHANG Lun△
Department of Maxillofacial&E.N.T（ear，nose，and throat）Oncology，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital；National Clinical Research Center of Cancer；Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy，Tianjin 300060，China△

ObjectiveTo investigate the influence of long non-coding RNA HOTAIR in proliferation and apoptosis of human tongue squamous cell carcinoma in vitro and in vivo.MethodssiHOTAIR was used to inhibit the HOTAIR expression in Tb3.1 human tongue squamous cell carcinoma cell line.The experiments were divided into siHOTAIR group，nonsense sequence group and blank control group.Real-time PCR was used to detect the HOTAIR expression.MTT assay was employed to determine the cell survival.The expression levels of Bcl2，BAX，caspase-3，cleaved caspase-3 were examined by Western blot assay.Tb3.1 xenograft tumor model was established in BALB/c nude mice，and the tumor model was divided into control group，negative group，and siHOTAIR treated group.The tumor tissues were measured by immunohistochemistry stain（IHC）and TUNEL assay.ResultsThe detection of real-time PCR showed that HOTAIR expression was reduced after treated with siHOTAIR.Western blots assay showed that Bcl-2 protein was suppressed while cleaved caspase-3 and BAX protein were up-regulated after treated with siHOTAIR.MTT assay indicated that the cell survival rate was significantly reduced in siHOTAIR treated group.Flow cytometry detected that apoptosis levels were increased in siHOTAIR group.The level of cell senescence was higher in the siHOTAIR group than that of control group. Results of IHC indicated that Ki-67 and Bcl-2 protein of tumor tissue were inhibited，while BAX and cleaved caspase-3protein expressions were elevated simultaneously in the siHOTAIR group.TUNEL assay suggested that more apoptosis was observed in siHOTAIR group.ConclusionHOTAIR can affect proliferation and apoptosis of tongue squamous cancer cells.HOTAIR may be one of the new candidate targets for human tongue cancer therapy.

tongue neoplasms；carcinoma，squamous cell；RNA，small interfering；cell proliferation；apoptosis；HOTAIR

R739.86

A

10.11958/20150403

国家自然科学基金资助项目（81172573）

天津医科大学肿瘤医院颌面耳鼻喉科，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室（邮编300060）

郭文宇（1990），男，硕士在读，主要从事头颈部肿瘤的诊治研究

△通讯作者E-mail:Lun_zhang_jing@yahoo.com.cn